《ImmunoTargets and Therapy》：Early Assessment of Circulating Tumor Cells and Their PD-L1 Expression as Predictive Biomarkers in Metastatic Non-Small Cell Lung Cancer Patients Treated with Immunotherapy: An Exploratory Study
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背景： 转移性非小细胞肺癌（metastatic Non-Small Cell Lung Cancer，mNSCLC）的预后近年来有所改善，但治疗获益仍存在异质性，凸显了对可靠生物标志物的需求。液体活检技术，包括循环肿瘤细胞（Circulatin
摘要专业翻译
背景： 转移性非小细胞肺癌（metastatic Non-Small Cell Lung Cancer，mNSCLC）的预后近年来有所改善，但治疗获益仍存在异质性，凸显了对可靠生物标志物的需求。液体活检技术，包括循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）分析及其上程序性死亡配体-1（Programmed death-ligand 1，PD-L1）表达（PD-L1-CTCs）的检测，已成为有前景的工具。
材料与方法： 研究人员在一组接受免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors，ICIs）治疗的mNSCLC患者队列中开展了一项回顾性研究，以评估这些生物标志物在基线和治疗早期时间点的预测价值。CTCs通过ClearCell? FX平台捕获，随后通过免疫染色评估PD-L1表达。同时进行了纳武利尤单抗（nivolumab）和帕博利珠单抗（pembrolizumab）的治疗药物监测。
结果： 共纳入37例mNSCLC患者。CTCs计数中位数为每7.5 mL全血35个（标准差±939）。51%的患者检测到PD-L1-CTCs。未发现PD-L1-CTCs与肿瘤福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded，FFPE）组织上PD-L1表达之间存在相关性。高于中位数的CTCs计数与较差结局趋势相关。相反，CTCs上的PD-L1表达不能预测治疗反应。大多数患者在第三疗程时的ICIs谷浓度高于10 μg/mL，与临床反应无关。
结论： 基线CTCs水平倾向于与临床结局相关，而CTCs上的PD-L1表达则无此相关性。治疗期间早期评估这两个参数的变化并未改善ICIs治疗下的结局预测。需要更大规模、更长随访时间和更深入分析的研究来进一步确定基于CTCs的生物标志物的预后和预测价值。
论文解读
一、研究背景与意义
肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，多数患者在确诊时已处于转移阶段，治愈机会极为有限。目前，铂类化疗联合免疫检查点抑制剂（ICIs）已成为无驱动基因突变的转移性非小细胞肺癌（mNSCLC）一线治疗的金标准，其疗效优于单纯化疗。然而，并非所有患者均能从免疫治疗中获益，部分患者获益甚微甚至无效，治疗获益存在显著异质性。尽管肿瘤组织程序性死亡配体-1（PD-L1）免疫组化染色对治疗决策具有参考价值，但受限于肿瘤的时空异质性，其预测效能并不完善。在此背景下，液体活检作为一种微创检测手段，通过简单抽血即可反映肿瘤异质性，为早期检测、预后判断和个体化治疗策略制定提供了有前景的替代方案。循环肿瘤细胞（CTCs）分析在NSCLC的分子特征刻画和预后评估中已显示出应用价值，其核心优势在于多功能性和实时监测能力，尤其适用于免疫治疗过程中的动态监测。此外，25%至67%的NSCLC患者在一线进展时无法接受再次活检，CTCs的非侵入性采集优势尤为突出。然而，CTCs在外周血中极为稀少，其分离和富集面临技术挑战，且其在NSCLC患者管理中的定位仍不明确。自2016年Nicolazzo等首次报道NSCLC中CTCs的PD-L1表达以来，相关研究不断涌现，但人群异质性、癌种差异以及CTCs分离和标记技术的不同限制了现有结论的推广。早期评估CTCs及其PD-L1表达的动态变化，有望改善转移性NSCLC的治疗分配和个体化管理。因此，本研究旨在探索基线CTCs水平、CTCs上PD-L1表达与接受标准治疗（一线或二线ICIs±化疗）的晚期NSCLC患者治疗反应和生存之间的关联，并评估治疗早期这些指标变化的预后价值。
二、研究设计与技术方法
本研究为一项在里昂大学医院（LUH）开展的回顾性观察研究，纳入37例经组织学确诊的晚期NSCLC成人患者，均来自MADMAS队列。入组标准为接受一线或二线含免疫检查点抑制剂（ICIs）的系统治疗，可联合铂类化疗，且基线原发灶福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的PD-L1状态已知。样本采集时间为2021年3月10日至2023年11月1日。研究在基线和第3次给药日（T3，即治疗6周后）两个时间点采集外周血。CTCs富集采用ClearCell? FX1平台配合CTChip? FR1S微流控芯片，基于惯性微流控原理进行富集，随后进行细胞离心涂片和免疫荧光染色。PD-L1染色采用抗PD-L1抗体（Cell Signaling, 86744S），以CD45、CD41和CD15作为白细胞和血小板排除标志物，DAPI用于核染色。CTCs计数为半定量手动计数，通过涂片比例换算回每7.5 mL全血的标准化数值。肿瘤组织PD-L1表达采用22C3 pharmDx检测评估肿瘤比例评分（TPS）。此外，研究还进行了循环游离DNA（cfDNA）提取和77基因panel测序，以及纳武利尤单抗和帕博利珠单抗的血药浓度监测。
三、研究结果
患者基线特征与治疗暴露： 研究纳入37例患者，中位随访时间672天（标准差±356天）。以男性为主，中位年龄64岁，体能状态良好。腺癌为主要组织学类型（68%），95%为IV期。91%接受一线治疗，主要为铂类化疗联合ICIs。54%的患者接受了放疗。从首次治疗到首次影像学评估的中位时间为7.9周（标准差±2）。
ICIs血药浓度与临床反应： 首次肿瘤学评估时帕博利珠单抗中位谷浓度在疾病进展（PD）、疾病稳定（SD）和部分缓解（PR）组间无统计学显著差异，分别为26.0（标准差±14.6）、22.6（标准差±8）和22.2（标准差±7.9）μg/mL。仅2例接受纳武利尤单抗治疗的患者均为二线治疗且归入PD组。
基线CTCs计数与预后： 基线CTCs计数中位数为每7.5 mL全血35个（标准差±938.8）。基线CTCs计数高于中位数（>35/7.5 mL）的10例患者表现出较差的无进展生存期（PFS），曲线早期即出现分离并持续存在，但差异未达到统计学显著性（log-rank p = 0.14）。
治疗早期CTCs变化与反应： 首次临床评估时CTCs计数中位数为31.5（每7.5 mL全血，标准差±628）。PD、SD和PR组在首次评估时的中位CTCs计数分别为43（标准差±659）、31（标准差±859）和36（标准差±138），组间差异无统计学意义（Kruskal–Wallis检验，p = 0.76）。视觉上PR和SD患者的CTCs计数下降较PD组更为明显，但未观察到统计学显著的相关性。
CTCs上PD-L1表达与预后： 在可检测到CTCs的患者中，基线CTCs上PD-L1表达中位数为7%。以7%为截断值进行二分化后，未能区分生存差异（log-rank p = 0.70）。PD、SD和PR组的基线PD-L1表达分别为17.1（标准差±14.2）、5.7（标准差±31.6）和13（标准差±37.8），三组间无显著差异。
PD-L1表达的纵向变化： 治疗过程中PD-L1表达变化呈异质性，各结局组（包括部分缓解者）均观察到表达升高。PD组PD-L1阳性CTCs数量中位变化为13（标准差±28.6），SD和PR组均为0（标准差分别为±47.0和±47.4），差异无统计学意义（Kruskal–Wallis检验，p = 0.3682）。
PD-L1-CTCs与肿瘤组织PD-L1的相关性： 在基线可检测到CTCs的32例患者中，CTCs上PD-L1表达与肿瘤组织PD-L1表达之间未发现相关性（Spearman相关系数?0.28，p = 0.13）。
CTCs计数与突变状态： 基于cfDNA的NGS基因panel检测结果显示，突变组与野生型肿瘤组之间的基线CTCs计数无统计学显著差异（Wilcoxon检验，p = 0.51）。
四、讨论与结论
本研究的优势在于队列的代表性和同质性，聚焦于接受一线ICIs治疗的晚期NSCLC患者，且大部分患者按照当前指南接受ICIs联合铂类化疗，有别于既往多聚焦于单药免疫治疗和重度经治患者的研究。研究发现基线CTCs水平较高的患者呈现较差预后的趋势，支持CTCs计数作为预后生物标志物的潜在价值。然而，CTCs上PD-L1表达与肿瘤组织PD-L1表达之间缺乏相关性，且PD-L1-CTCs不能预测免疫治疗反应，这与既往部分文献报道存在差异，可能归因于化疗联合ICIs的影响、队列间的生物学差异以及手动计数等技术因素。治疗早期（中位7.9周）CTCs水平和PD-L1表达的动态变化未能提供额外的预后信息，可能与高肿瘤负荷、人群异质性及CTCs清除延迟有关。ICIs血药浓度在反应组与非反应组间无差异，提示多数患者已达到饱和靶点所需的最低血药浓度阈值，但治疗药物监测仍可能为个体化给药方案提供参考。研究的主要局限性包括半定量手动计数的劳动密集性和操作者间变异、样本量较小导致的统计效能不足、放疗对CTCs脱落的潜在影响以及治疗方案的一定异质性。结论认为，基线CTCs水平倾向于与临床结局相关，而CTCs上PD-L1表达无预后价值，早期动态评估未能改善结局预测。未来研究应优先开展更大规模的前瞻性队列，采用标准化、自动化的CTCs/PD-L1检测方法，并结合纵向多组学分析以阐明ICIs原发和获得性耐药的机制，同时探索CTCs上PD-L1表达在更早期疾病中指导辅助或新辅助免疫治疗选择的可能性。
