《Brain Research Bulletin》：The PVN Astrocyte–Excitatory Neuron Functional Axis Mediates Chronic Stress-Induced Depressive-Like Behaviors
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重度抑郁症（MDD）是一种高度流行的精神障碍，以持续性情绪低落、兴趣或快感缺失、反复出现死亡相关念头以及多种情绪、认知和躯体症状为特征。尽管对抑郁症病理生理学的认识已取得重要进展，但MDD确切的神经生物学机制仍未完全阐明，这限制了基于机制的有效治疗策略的开发。
重度抑郁症（MDD）是一种高度流行的精神障碍，以持续性情绪低落、兴趣或快感缺失、反复出现死亡相关念头以及多种情绪、认知和躯体症状为特征。尽管对抑郁症病理生理学的认识已取得重要进展，但MDD确切的神经生物学机制仍未完全阐明，这限制了基于机制的有效治疗策略的开发。越来越多的证据表明，除神经元功能障碍外，胶质细胞功能异常在抑郁症的发生与进展中同样发挥关键作用。在各类胶质细胞中，星形胶质细胞因其在维持突触稳态、调节神经递质代谢及调控神经环路活动中的重要作用而日益受到关注。MDD患者的尸检和神经影像学研究已揭示出显著的星形胶质细胞改变，包括星形胶质细胞密度降低、形态学异常、星形胶质细胞特异性标志物表达下降、谷氨酸摄取受损以及神经发生紊乱。重要的是，星形胶质细胞对应激的响应表现出显著的脑区特异性。既往动物研究已证实，慢性应激可诱导海马和前额叶皮层星形胶质细胞的结构重塑，表现为胞体面积减小、突起复杂性降低及星形胶质细胞网络功能受损。相反，包括腹侧被盖区和外侧缰核在内的多个应激相关脑区中的星形胶质细胞在慢性应激暴露后表现出反应性激活。这些发现提示，不同脑区的星形胶质细胞可能通过各自不同的适应性或适应不良性反应参与抑郁症的发生。内侧前额叶皮层（mPFC）、伏隔核（NAc）、下丘脑室旁核（PVN）和基底外侧杏仁核（BLA）是情绪与动机加工相关神经环路的关键组成部分，并已被广泛证实与负性情绪和情感行为密切相关。除这些经典的情感与奖赏相关环路外，PVN是整合应激相关信号和调节神经内分泌反应的中枢枢纽，尤其是通过其在控制下丘脑–垂体–肾上腺（HPA）轴中的关键作用。尽管经典的情感与奖赏相关脑区广泛参与情绪与动机加工，但PVN通过HPA轴在整合应激信号和调节神经内分泌反应中发挥独特作用，使其成为理解慢性应激与抑郁症之间联系的关键脑区。PVN活动失调导致HPA轴过度激活，而后者是抑郁症相关最显著的神经生物学特征之一。然而，仅凭HPA轴异常无法完全解释MDD中观察到的复杂行为和神经改变，提示PVN内的细胞间相互作用也可能参与应激诱导的情绪功能障碍。既往研究主要聚焦于PVN神经元及其长程投射环路，而局部胶质细胞对应激整合和神经元兴奋性调节的贡献在很大程度上仍未被探索。因此，阐明PVN星形胶质细胞与局部兴奋性神经元之间的功能性相互作用，可能为抑郁症的细胞机制提供重要见解。星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞类型，通过与神经元的动态双向通讯主动参与神经环路调控。通过调节神经递质摄取、释放胶质递质、维持代谢支持以及调控突触结构和功能，星形胶质细胞直接影响神经元兴奋性和突触可塑性。因此，星形胶质细胞–神经元功能偶联是维持正常脑功能和对环境挑战产生适应性反应的重要机制。近期研究表明，慢性应激可诱导特定脑区兴奋性神经元过度激活并破坏兴奋–抑制平衡，这被认为是促成抑郁症的重要病理机制。与此同时，慢性应激可触发星形胶质细胞反应性改变和功能重塑，影响谷氨酸稳态、转运体功能和兴奋性突触传递，从而促进神经环路功能障碍。然而，PVN星形胶质细胞是否通过调节兴奋性神经元活动来调控应激诱导的抑郁样行为，以及所涉及的潜在细胞机制，在很大程度上仍不清楚。在本研究中，研究人员建立了慢性束缚应激（CRS）诱导的抑郁样行为小鼠模型，并结合免疫荧光染色、化学遗传学操控和体内光纤光度记录，探究PVN星形胶质细胞的功能作用及其与兴奋性神经元的相互作用。研究人员发现，慢性应激诱导PVN星形胶质细胞反应性激活，并伴随星形胶质细胞钙动力学的异常改变。双向化学遗传学操控显示，激活PVN星形胶质细胞足以在na?ve小鼠中诱导抑郁样行为，而抑制星形胶质细胞活动则可缓解CRS诱导的行为异常。此外，研究人员证实，调节PVN星形胶质细胞活动可直接影响CaMKIIα阳性兴奋性神经元的激活状态和钙动力学，表明PVN星形胶质细胞与兴奋性神经元群体之间存在功能性偶联。总体而言，研究人员的发现确定了PVN星形胶质细胞–兴奋性神经元功能轴是慢性应激诱导抑郁样行为的重要细胞机制，并为胶质细胞调控抑郁症相关神经环路提供了新的见解，凸显了抑郁症的潜在治疗靶点。
抑郁症（MDD）是全球高发的精神障碍，其神经生物学机制尚未充分阐明。长期以来研究主要聚焦于神经元功能障碍，而胶质细胞尤其是星形胶质细胞在抑郁症中的作用逐渐受到重视。星形胶质细胞通过维持突触稳态、调控神经递质代谢和调节神经环路活动参与情绪调控，MDD患者存在星形胶质细胞密度下降、形态异常和谷氨酸摄取受损等改变。值得注意的是，星形胶质细胞对应激的响应具有显著脑区特异性：海马和前额叶皮层表现为结构萎缩，而腹侧被盖区和外侧缰核则表现为反应性激活。下丘脑室旁核（PVN）是整合应激信号和调控下丘脑–垂体–肾上腺（HPA）轴的核心枢纽，PVN活动失调导致HPA轴过度激活是抑郁症最显著的神经生物学特征之一，但仅凭HPA轴异常难以完全解释MDD的复杂改变，提示PVN内细胞间相互作用亦参与其中。既往研究主要关注PVN神经元及其长程投射环路，而局部星形胶质细胞对应激整合和神经元兴奋性调控的贡献尚不清楚。慢性应激可诱导特定脑区兴奋性神经元过度激活并破坏兴奋–抑制平衡，也可触发星形胶质细胞反应性改变，但PVN星形胶质细胞是否通过调节兴奋性神经元活动介导抑郁样行为仍未知。为此，研究人员建立慢性束缚应激（CRS）小鼠模型，结合免疫荧光染色、化学遗传学操控和体内光纤光度记录，系统探究PVN星形胶质细胞的功能作用及其与兴奋性神经元的相互作用。研究得出，CRS诱导PVN星形胶质细胞反应性激活并伴钙活动增强；双向化学遗传学操控证明激活PVN星形胶质细胞足以诱导na?ve小鼠抑郁样行为，而抑制其活动可缓解CRS诱导的行为异常；PVN星形胶质细胞活动可双向调节局部CaMKIIα阳性兴奋性神经元的激活状态和钙动力学；转录组筛选结合qPCR验证发现Timp4和Manf是应激相关的候选星形胶质细胞来源分泌因子。该研究确立了PVN星形胶质细胞–兴奋性神经元功能轴在慢性应激诱导抑郁样行为中的关键作用，为胶质细胞调控抑郁症相关神经环路提供了新见解，并提示靶向星形胶质细胞功能可能成为抑郁症的潜在治疗策略。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：建立CRS小鼠模型（每日束缚6 h，连续21天）；采用化学遗传学技术，通过PVN双侧注射星形胶质细胞特异性AAV-GfaABC1D-hM3D(Gq)-mCherry或AAV-GfaABC1D-hM4Di-mCherry病毒并结合腹腔注射氯氮平-N-氧化物（CNO）实现星形胶质细胞的双向操控；采用体内光纤光度记录（fiber photometry），通过AAV-GfaABC1D-GCaMP6s或AAV-CaMKIIα-GCaMP6s监测PVN星形胶质细胞和兴奋性神经元的钙动力学；采用免疫荧光染色及荧光原位杂交（FISH）检测GFAP、c-Fos、CaMKIIα、Iba-1、NeuroTrace及Vglut2 mRNA；采用Sholl分析定量星形胶质细胞形态；基于公共单细胞RNA-seq数据集GSE201032（来源于接受21天慢性温和应激CMS范式的小鼠PVN）筛选候选基因，并以qRT-PCR在全PVN组织匀浆中验证Timp4、Manf和Wnt7a表达。实验动物为宁波大学医学院提供的成年雄性C57BL/6 J小鼠（6–8周龄）。
3.1 慢性束缚应激诱导抑郁样行为并促进PVN反应性星形胶质细胞激活
研究人员将小鼠随机分为对照组和CRS组，CRS组每日束缚6 h连续21天，随后进行旷场实验（OFT）、悬尾实验（TST）、强迫游泳实验（FST）和糖水偏好实验（SPT）。结果显示，与对照组相比，CRS小鼠OFT中央区探索时间显著减少、TST和FST不动时间增加、SPT糖水偏好率降低，表明CRS可靠诱导抑郁样行为。免疫荧光染色显示CRS小鼠PVN中GFAP阳性星形胶质细胞数量显著增加；Sholl分析显示CRS小鼠星形胶质细胞胞体面积增大、与同心圆交叉数增多，表明慢性应激诱导PVN星形胶质细胞反应性激活和形态重塑。
3.2 慢性束缚应激增强PVN星形胶质细胞钙活动
研究人员向PVN单侧注射星形胶质细胞特异性钙指示病毒AAV-GfaABC1D-GCaMP6s并植入光纤，免疫荧光验证GCaMP6s与GFAP广泛共标。体内光纤光度记录显示，居家笼条件下CRS小鼠PVN星形胶质细胞钙瞬变事件频率显著高于对照组；在TST中，CRS小鼠在不动期即表现出升高的基础钙信号，且从不动向挣扎转换时钙活动升高幅度大于对照组。结果表明CRS在基础状态和应激相关行为状态下均持续增强PVN星形胶质细胞钙活动，提示其功能重塑与过度激活。
3.3 化学遗传学激活PVN星形胶质细胞诱导na?ve小鼠抑郁样行为
研究人员向na?ve小鼠PVN双侧注射AAV-GfaABC1D-hM3D(Gq)-mCherry或对照病毒，免疫荧光证实mCherry与GFAP广泛共标而与Iba-1和NeuroTrace共标比例很低，验证了星形胶质细胞靶向特异性。连续3天CNO给药后，hM3Dq组GFAP阳性星形胶质细胞数量增加，Sholl分析显示胞体面积增大、交叉数增多，表明星形胶质细胞激活和结构复杂性增强。行为学上，CNO给药前两组无显著差异，给药后hM3Dq组表现出糖水偏好降低、OFT中央区探索减少、TST和FST不动时间增加等抑郁样表型。结果表明选择性激活PVN星形胶质细胞足以诱导na?ve小鼠抑郁样行为。
3.4 化学遗传学抑制PVN星形胶质细胞缓解CRS诱导的抑郁样行为
研究人员向PVN双侧注射AAV-GfaABC1D-hM4Di-mCherry或对照病毒后进行CRS暴露，免疫荧光同样验证了星形胶质细胞靶向特异性。连续3天CNO给药后，CRS-hM4Di组GFAP阳性星形胶质细胞数量较CRS-mCherry组显著减少，Sholl分析显示胞体面积减小、交叉数减少，表明星形胶质细胞形态复杂性和反应性减弱。行为学上，CNO给药前两组抑郁样行为相当，给药后抑制PVN星形胶质细胞显著缓解CRS诱导的抑郁样行为，表现为OFT中央区探索时间增加、TST和FST不动时间减少、SPT糖水偏好升高。结果表明抑制PVN星形胶质细胞活动可有效减轻CRS诱导的抑郁样行为。
3.5 慢性束缚应激增强PVN兴奋性神经元活动
研究人员以CaMKIIα作为PVN兴奋性神经元标志物，并通过Vglut2 mRNA原位杂交联合CaMKIIα免疫荧光观察到二者在PVN部分共标以验证该策略。CaMKIIα与c-Fos双免疫荧光染色显示，CRS小鼠PVN中CaMKIIα?/c-Fos?双阳性神经元比例较对照组显著增加，表明慢性应激后PVN兴奋性神经元激活增强。进一步向PVN单侧注射AAV-CaMKIIα-GCaMP6s并进行体内光纤记录，结果显示CRS小鼠PVN兴奋性神经元钙活动事件频率显著高于对照组，表明慢性应激增加PVN兴奋性神经元基础钙活动，提示PVN内兴奋性神经元活动增强可能参与应激诱导的情绪障碍。
3.6 化学遗传学激活PVN星形胶质细胞增强兴奋性神经元活动
研究人员向na?ve小鼠PVN注射AAV-GfaABC1D-hM3D(Gq)-mCherry或对照病毒，连续3天CNO给药后进行CaMKIIα与c-Fos双免疫荧光染色，发现hM3Dq组PVN中CaMKIIα?/c-Fos?双阳性兴奋性神经元比例较mCherry组显著增加。进一步将AAV-CaMKIIα-GCaMP6s与化学遗传学病毒共注射并结合光纤记录，发现hM3Dq组PVN CaMKIIα?兴奋性神经元钙信号事件频率较mCherry组增加。结果表明激活PVN星形胶质细胞可增强局部兴奋性神经元活动。
3.7 化学遗传学抑制PVN星形胶质细胞降低CRS小鼠兴奋性神经元活动
研究人员向PVN注射AAV-GfaABC1D-hM4Di-mCherry或对照病毒后行21天CRS暴露，连续3天CNO给药后进行CaMKIIα与c-Fos双免疫荧光染色，发现CRS-hM4Di组PVN中CaMKIIα?/c-Fos?双阳性兴奋性神经元比例较CRS-mCherry组显著降低。进一步将AAV-CaMKIIα-GCaMP6s与化学遗传学病毒共注射并结合光纤记录，发现hM4Di组CRS小鼠PVN CaMKIIα?兴奋性神经元钙信号事件频率较mCherry组显著降低。结果表明抑制PVN星形胶质细胞可降低CRS小鼠兴奋性神经元活动，提示PVN星形胶质细胞参与调控应激诱导的兴奋性神经元激活。
3.8 转录组分析鉴定慢性应激改变的PVN星形胶质细胞来源候选分泌因子
研究人员基于公共单细胞RNA-seq数据集GSE201032（来源于接受21天CMS范式的小鼠PVN星形胶质细胞）进行候选基因筛选，发现多个星形胶质细胞相关基因在慢性应激后差异表达，其中Timp4、Manf和Wnt7a编码可能参与星形胶质细胞介导的细胞间通讯的分泌性调控因子。qRT-PCR验证显示，CRS小鼠PVN中Timp4和Manf mRNA表达水平较对照组显著升高，而Wnt7a表达无显著变化。结果表明慢性应激诱导PVN特定星形胶质细胞来源分泌因子表达改变，Timp4和Manf可能是参与CRS诱导星形胶质细胞功能重塑及星形胶质细胞–兴奋性神经元相互作用的潜在分子介质。
讨论部分指出，本研究首先建立了稳健的CRS抑郁样行为模型，组织学分析显示CRS显著增加PVN中GFAP阳性星形胶质细胞数量并伴胞体增大和突起复杂性增加，表明慢性应激诱导PVN星形胶质细胞反应性激活和结构重塑。光纤光度记录进一步显示CRS小鼠PVN星形胶质细胞在居家笼条件下基础钙活动升高，在TST不动期维持较高钙活动且在向挣扎转换时钙反应增强，提示慢性应激不仅引起形态改变还导致持续的功能重塑；长期应激可能驱动星形胶质细胞持续反应性，使其由稳态调节细胞转变为突触功能和神经环路活动的主动调节者。双向化学遗传学操控表明，激活PVN星形胶质细胞足以在na?ve小鼠中诱导抑郁样行为，而抑制则可显著缓解CRS诱导的行为异常，说明PVN星形胶质细胞激活并非慢性应激的继发结果，而是主动参与抑郁样行为的发生。机制上，CRS后PVN CaMKIIα阳性兴奋性神经元c-Fos表达增加、基础钙活动升高；激活PVN星形胶质细胞可增强CaMKIIα阳性兴奋性神经元活动，而抑制星形胶质细胞可抑制CRS诱导的神经元过度活跃，表明PVN星形胶质细胞能够调节局部兴奋性神经元功能，并可能通过扰乱PVN神经网络兴奋状态参与抑郁样行为。转录组筛选结合qPCR验证发现CRS后PVN中Timp4和Manf表达升高：Timp4属于金属蛋白酶组织抑制因子家族，参与细胞外基质重塑和突触微环境调控，进而可能影响神经元兴奋性；Manf是内质网应激相关分泌蛋白，参与细胞稳态维持和神经保护反应，可能通过调节应激反应通路和神经递质受体相关信号影响神经环路功能，二者可能是参与应激诱导星形胶质细胞–神经元通讯的潜在星形胶质细胞来源信号因子。作者还讨论了不同应激模型对PVN的影响：既往研究显示慢性可变应激改变PVN促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）神经元的兴奋性突触传递，慢性社会挫败应激改变PVN特定细胞类型的基因表达；GSE201032相关研究显示既往CMS暴露改变PVN对急性束缚应激的转录反应且存在性别和细胞类型依赖性，因此CRS下Wnt7a无显著变化可能反映应激条件差异而非原数据集假阳性，采样时间、性别和细胞组成差异以及公共数据集检测单个星形胶质细胞而qRT-PCR使用PVN组织（亚群改变可能在组织水平被稀释）均可能解释该差异；Timp4和Manf的验证支持其作为跨应激模型进一步研究的候选分子，Wnt7a的差异也提示需区分共享应激反应与特定应激条件依赖的改变，需要在匹配采样时间和细胞特异性分析条件下直接比较不同模型的PVN星形胶质细胞。作者指出PVN是整合应激信号和调节神经内分泌反应的关键下丘脑核团，既往研究主要关注PVN神经元活动和HPA轴功能障碍，而PVN胶质细胞的作用关注较少；本研究通过证明PVN星形胶质细胞通过调节局部兴奋性神经元活动调控慢性应激相关情绪功能障碍，提供了新的细胞视角，拓展了对PVN介导应激调控的理解。作者同时指出研究局限性：第一，研究主要聚焦CaMKIIα阳性兴奋性神经元，尽管CaMKIIα常用于靶向兴奋性神经元，但其特异性可能因脑区而异，PVN中CaMKIIα与Vglut2的部分共标支持其靶向一个兴奋性神经元亚群，但仍需基于Vglut2的方法进一步验证所靶向神经元群体的身份；PVN包含多种神经元群体，未来应进一步研究PVN星形胶质细胞与不同神经元亚型（包括CRH神经元、催产素神经元和谷氨酸能神经元）的特异性相互作用。第二，CRS模型虽有效再现慢性应激相关行为异常，但未直接评估CNO给药后化学遗传学效应对SPT的持续时间，因此无法确认这些效应在整个12 h SPT期间持续存在，结果反映的是CNO给药后的总体行为结局而非持续化学遗传学调控；此外还需采用其他抑郁模型和人类样本验证以确定PVN星形胶质细胞功能障碍在MDD中的临床相关性。第三，星形胶质细胞调控兴奋性神经元活动的分子机制仍有待完全阐明。第四，性别是可能影响MDD病理生理的重要生物学变量，本研究仅使用成年雄性C57BL/6 J小鼠，因此所鉴定的星形胶质细胞介导机制是否同样存在于雌性尚不清楚，未来需纳入雌性小鼠以确定PVN星形胶质细胞–神经元相互作用及其对应激诱导抑郁样行为贡献是否存在性别差异。
研究结论部分译为：总之，慢性束缚应激诱导下丘脑室旁核（PVN）持续性的星形胶质细胞重塑并增强兴奋性神经元活动。双向化学遗传学操控表明，PVN星形胶质细胞同时调控抑郁样行为和兴奋性神经元功能。光纤光度记录进一步揭示了PVN星形胶质细胞与兴奋性神经元之间的动态功能偶联。此外，CRS诱导的Timp4和Manf上调提示了星形胶质细胞介导应激反应的潜在分子机制。总体而言，这些发现确定PVN星形胶质细胞–兴奋性神经元功能轴是慢性应激诱导抑郁样行为的关键调控因素，也是抑郁症的潜在治疗靶点。
