《Microbiology Research》：Aerobic Cutibacterium acnes/Staphylococcus epidermidis Dual-Species Biofilms: Matrix Components In Vitro and Promotion of Cutibacterium acnes Growth on Human Skin Ex Vivo
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厌氧的痤疮皮肤杆菌（Cutibacterium acnes）和兼性厌氧的凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci，CoNS）是人类皮肤微生物群中数量丰富的成员。痤疮皮肤杆菌在与CoNS共培养时可在有氧条
摘要专业翻译
厌氧的痤疮皮肤杆菌（Cutibacterium acnes）和兼性厌氧的凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci，CoNS）是人类皮肤微生物群中数量丰富的成员。痤疮皮肤杆菌在与CoNS共培养时可在有氧条件下形成生物膜，这一过程可能促进其在皮肤上的定植。本研究在体外对痤疮皮肤杆菌与CoNS形成的有氧双菌种生物膜进行了表征。痤疮皮肤杆菌与CoNS共培养时的有氧生长在多个系统发育多样化的痤疮皮肤杆菌分离株中均得以实现。此外，痤疮皮肤杆菌在与CoNS的竞争中占据优势，在有氧共培养5 d后占回收菌落形成单位（colony-forming unit，CFU）的90%以上。机械破坏实验表明，CoNS生物膜可通过涡旋振荡轻易脱落，而痤疮皮肤杆菌的高效脱落则需要超声处理，提示其与生物膜基质和/或培养器皿表面的结合更为紧密。所有受试痤疮皮肤杆菌菌株均产生可检测的胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）和聚N-乙酰氨基葡萄糖（poly-N-acetylglucosamine，PNAG），且这两种组分均有助于有氧双菌种生物膜的结构完整性和杀菌剂抗性。最后，表皮葡萄球菌（S. epidermidis）在离体人皮肤外植体上支持痤疮皮肤杆菌的有氧生长。这些发现为痤疮皮肤杆菌在有氧多菌种生物膜中持续存在并占据优势的能力提供了机制性见解，确定eDNA和PNAG为生物膜破坏的潜在靶点，并提示与CoNS的合作可能促进痤疮皮肤杆菌在人类皮肤上的定植和持续存在。
论文解读
一、研究背景与目的
痤疮皮肤杆菌（Cutibacterium acnes）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）是人类皮肤微生物群中数量最丰富的两种革兰氏阳性菌。两者均被认为是有益菌，通过定植抵抗（colonization resistance）维持皮肤微生态稳态并抑制金黄色葡萄球菌（S. aureus）等病原体。然而，这两种菌也与寻常痤疮和植入式医疗器械感染密切相关。临床上，痤疮皮肤杆菌和表皮葡萄球菌经常从皮肤样本和医疗器械感染中被共同分离，提示两者在健康和疾病相关的微生物群落中可能存在相互作用。
痤疮皮肤杆菌是一种耐氧厌氧菌（aerotolerant anaerobe），其生长受氧气抑制，传统上需要在厌氧条件下培养。此前研究已证实，痤疮皮肤杆菌在与表皮葡萄球菌（一种兼性厌氧菌）共培养时，可在有氧条件下形成生物膜。然而，两个物种在生物膜中的相对丰度、物理结合方式、特定基质组分对生物膜完整性和杀菌剂抗性的贡献，以及该相互作用与痤疮皮肤杆菌在人体皮肤上生长的相关性，尚未得到充分表征。本研究旨在系统回答上述问题，为理解痤疮皮肤杆菌在直接暴露于大气氧的皮肤区域如何定植和持续存在提供机制性见解。
二、研究内容与主要结论
研究人员扩展了此前的研究，使用多个系统发育多样化的痤疮皮肤杆菌分离株，在有氧条件下与CoNS共培养，考察了双菌种生物膜中两个物种的相对丰度及其对机械脱落的敏感性，并研究了eDNA和PNAG对生物膜结构完整性和杀菌剂抗性的贡献。此外，研究人员还在离体人皮肤外植体上验证了表皮葡萄球菌是否支持痤疮皮肤杆菌的有氧生长。研究得出以下主要结论：有氧条件下与CoNS共培养生长是痤疮皮肤杆菌的普遍表型；痤疮皮肤杆菌在有氧共培养中可显著竞争过表皮葡萄球菌，占回收CFU的90%以上；痤疮皮肤杆菌在双菌种生物膜中与表面结合更为紧密；eDNA和PNAG均有助于双菌种生物膜的结构完整性，但两者在生物膜稳定性和杀菌剂抗性中发挥不同的时间性和特异性作用；表皮葡萄球菌在离体人皮肤外植体上支持痤疮皮肤杆菌的有氧生长和定植。
三、关键技术与方法
本研究采用的主要技术方法包括：双菌种生物膜培养体系（在聚丙烯管、玻璃管和96孔聚苯乙烯微孔板中进行有氧静态共培养）；选择性平板计数法（利用红霉素抗性和有氧/厌氧培养条件分别选择性计数痤疮皮肤杆菌和CoNS的CFU）；机械破坏实验（依次进行涡旋振荡和超声处理以评估生物膜与表面的结合强度）；酶处理实验（使用DNase I降解eDNA、分散素B（dispersin B）降解PNAG，评估两种基质组分对生物膜结构完整性的贡献）；结晶紫结合实验（定量总生物膜生物量）；琼脂糖凝胶电泳分析eDNA；聚合酶链式反应（PCR）检测PNAG生物合成基因icaA和icaD；免疫荧光显微镜（使用抗PNAG单克隆抗体F598）检测PNAG产生；杀菌剂杀伤实验（聚维酮碘和过氧化苯甲酰）；以及人皮肤外植体离体感染模型（皮肤样本来自以色列加利利医学中心整形与烧伤科接受腹部成形术的健康女性供体，获得机构伦理委员会批准，许可编号NHR-0261-24）。
四、研究结果
4.1 与凝固酶阴性葡萄球菌共培养的有氧生长是痤疮皮肤杆菌的普遍表型
为确认有氧共培养生长表型在痤疮皮肤杆菌中广泛保守，研究人员将6株额外的系统发育多样化的痤疮皮肤杆菌分离株与健康皮肤来源的表皮葡萄球菌JK4或人葡萄球菌（S. hominis）JK5在有氧条件下共培养。4 d后，所有6株痤疮皮肤杆菌在与表皮葡萄球菌JK4共培养时增加2.2–2.5个对数单位，与人葡萄球菌JK5共培养时增加2.2–2.7个对数单位，而所有菌株在单培养有氧条件下均不生长。该结果证实有氧条件下与CoNS共培养生长是多样化痤疮皮肤杆菌分离株的普遍表型。
4.2 痤疮皮肤杆菌在有氧条件下竞争过表皮葡萄球菌
将痤疮皮肤杆菌菌株2与表皮葡萄球菌JK4有氧共培养5 d后，痤疮皮肤杆菌占培养物中存活CFU的近95%。表皮葡萄球菌在第1 d占优势，但痤疮皮肤杆菌在第3 d后成为优势菌种。另外6株痤疮皮肤杆菌与表皮葡萄球菌JK4共培养5 d后，痤疮皮肤杆菌均占存活CFU的90–93%。该发现表明，生长缓慢的厌氧菌痤疮皮肤杆菌不仅能在有氧条件下存活，还能显著竞争过生长快速的兼性厌氧菌表皮葡萄球菌。
4.3 痤疮皮肤杆菌与表皮葡萄球菌共培养时形成紧密结合的生物膜
研究人员将表皮葡萄球菌JK4与6株不同的痤疮皮肤杆菌在聚丙烯管中共培养4 d，依次进行涡旋振荡和超声处理。结果显示，超声处理相比涡旋振荡并未显著增加表皮葡萄球菌的脱落量；而涡旋振荡仅释放了痤疮皮肤杆菌总CFU的2–8%（相对于超声处理回收量）。痤疮皮肤杆菌占每个双菌种生物膜回收CFU的58–87%。在厌氧单培养条件下，涡旋振荡仅脱落痤疮皮肤杆菌生物膜细胞的18–40%。这些结果表明，痤疮皮肤杆菌细胞可能更紧密地附着于聚丙烯表面或更深入地嵌入生物膜基质中，而有氧双菌种生物膜中痤疮皮肤杆菌的机械特性与厌氧单培养生物膜相似，但可能对聚丙烯的黏附更强。
4.4 实验菌株的eDNA和PNAG表型
所有CoNS和痤疮皮肤杆菌菌株均产生以高分子量DNA片段为主的eDNA。表皮葡萄球菌1457和M10菌株产生的eDNA量显著高于其他受试菌株（20–24 μg eDNA/mg湿细胞，其余菌株为0.1–0.7 μg/mg湿细胞）。1457菌株已知通过自溶素AtlE释放eDNA，其atlE突变体产生的eDNA显著减少。PNAG检测方面，表皮葡萄球菌1457产生强荧光信号，PNAG缺陷突变株M10无可检测信号，6株痤疮皮肤杆菌在与PNAG缺陷的表皮葡萄球菌1457-M10共培养时产生微弱但可重复的荧光信号，提示这些菌株产生低水平PNAG。健康皮肤来源的表皮葡萄球菌JK4缺乏icaA和icaD基因，无可检测的PNAG产生，且其生物膜对分散素B处理不敏感，被认定为典型的PNAG缺陷型皮肤分离株。
4.5 eDNA和PNAG促进双菌种生物膜的黏聚性
研究人员将5株痤疮皮肤杆菌分别与野生型表皮葡萄球菌1457及其PNAG缺陷突变株M10（ΔicaA）和eDNA缺陷突变株1457-ΔatlE共培养。所有5株痤疮皮肤杆菌在与3株表皮葡萄球菌共培养时均能在有氧条件下生长，表明表皮葡萄球菌的PNAG产生并非痤疮皮肤杆菌在双菌种生物膜中有氧生长所必需。由于ΔatlE突变株仍产生可检测量的eDNA，表皮葡萄球菌eDNA是否为必需因素无法确定。
酶处理实验表明，DNase I和分散素B均能显著降低完整生物膜的结晶紫结合量（A620从3.2降至0.15和1.5），并显著增加痤疮皮肤杆菌从上清液中的回收量（从7.4 log CFU/管增至8.4–8.5 log CFU/管），但均未显著改变表皮葡萄球菌的回收量。在预先涡旋去除松散附着生物量后，DNase I使痤疮皮肤杆菌回收量从4.6 log CFU/管增至7.4 log CFU/管，而分散素B仅增至4.8 log CFU/管，提示eDNA对紧密结合表型的贡献可能大于PNAG。在96孔微孔板实验中，痤疮皮肤杆菌与表皮葡萄球菌共培养产生的生物膜生物量显著高于两种单培养的加和效应，表明存在协同相互作用。DNase I显著脱落2 d和4 d龄双菌种生物膜，而分散素B仅对4 d龄生物膜有效，且分散素B介导的脱落程度与痤疮皮肤杆菌的丰度相关。由于所用表皮葡萄球菌菌株（M10和JK4）均为PNAG缺陷型，该结果支持痤疮皮肤杆菌来源的PNAG在成熟有氧双菌种生物膜稳定性中发挥作用。
4.6 eDNA增强双菌种生物膜对聚维酮碘杀伤的抗性
DNase I预处理在聚维酮碘浓度0.062%–0.5%范围内显著增强了对痤疮皮肤杆菌和表皮葡萄球菌的杀伤效果，而分散素B预处理对两种菌的聚维酮碘敏感性均无显著影响。该结果表明eDNA（而非PNAG）可能有助于有氧双菌种生物膜对聚维酮碘的抗性。
4.7 分散素B和过氧化苯甲酰对双菌种生物膜中痤疮皮肤杆菌存活的影响
单独使用分散素B或2%过氧化苯甲酰（benzoyl peroxide，BPO）处理均使痤疮皮肤杆菌CFU减少约2个对数单位，而依次使用分散素B后接BPO处理使CFU减少超过4个对数单位，表现为加性效应（而非此前使用PNAG过量产生菌株时观察到的协同效应）。该结果提示PNAG对痤疮皮肤杆菌在BPO处理中存活的保护作用可能取决于其在双菌种生物膜中的可用性。
4.8 表皮葡萄球菌在离体人皮肤外植体上促进痤疮皮肤杆菌的有氧生长
在两项独立实验中（分别使用两名不同供体的皮肤外植体），研究人员将痤疮皮肤杆菌菌株2单独或与表皮葡萄球菌JK4共同接种于皮肤表面。在实验1中，9个共接种位点中有5个回收了大量痤疮皮肤杆菌，而9个单独接种痤疮皮肤杆菌的位点均未回收任何痤疮皮肤杆菌CFU。在实验2中，7个共接种位点中有5个回收了大量痤疮皮肤杆菌，而6个单独接种位点均未回收痤疮皮肤杆菌。两项实验均证实表皮葡萄球菌在离体人皮肤上促进痤疮皮肤杆菌的建立和生长。
五、讨论与结论
本研究证实，痤疮皮肤杆菌与CoNS共培养时的有氧生长和生物膜形成是多样化分离株中的普遍表型，且痤疮皮肤杆菌可在有氧双菌种生物膜中占据优势地位。eDNA和PNAG在生物膜稳定性中发挥不同的时间性作用：eDNA在生物膜形成早期即贡献于结构稳定性，而PNAG（主要来源于痤疮皮肤杆菌）在生物膜成熟阶段更为重要。两种基质组分对抗菌药物敏感性具有特异性影响：eDNA增强对聚维酮碘的抗性，而痤疮皮肤杆菌来源的PNAG参与对过氧化苯甲酰的抗性。表皮葡萄球菌在离体人皮肤外植体上促进痤疮皮肤杆菌有氧生长的发现，表明该相互作用不仅限于人工表面或定义明确的实验室培养基，具有重要的生理相关性。
研究人员推测表皮葡萄球菌通过消耗氧气降低局部氧浓度从而支持痤疮皮肤杆菌生长，但该机制尚未直接验证，其他机制（如代谢物交换或其他种间相互作用）也可能参与其中。本研究的局限性包括：皮肤外植体实验仅涉及两名供体；未测量双菌种生物膜内的氧浓度；其他潜在基质组分（如蛋白质和其他多糖）未被研究；离体皮肤模型不能完全再现活体皮肤的生理、免疫和微生物复杂性。
综上所述，本研究证实表皮葡萄球菌在体外和离体人皮肤上均能促进痤疮皮肤杆菌的有氧生长，阐明eDNA和PNAG在双菌种生物膜结构完整性和杀菌剂抗性中的不同贡献，为理解种间相互作用如何影响痤疮皮肤杆菌在皮肤上的持续存在提供了机制性见解，并为将多菌种生物膜作为抗菌干预的潜在靶点奠定了基础。
