牛Mx1蛋白而非Mx2蛋白介导针对人源和禽源甲型流感病毒（包括H5N1分支2.3.4.4b）的抗病毒活性

《Journal of Virology》：Bovine myxovirus resistance protein (Mx)1, but not Mx2, mediates antiviral activity against human and avian influenza A viruses, including H5N1 clade 2.3.4.4b

　　

论文摘要翻译 高致病性禽流感（HPAI）H5N1分支2.3.4.4b病毒最近感染了美国的奶牛，引发了对人类外溢的担忧。牛宿主防御因子（包括黏病毒抗性蛋白bMx1和bMx2）的抗病毒作用研究仍相对不足。研究人员检测了HPAI H5N1感染后分化牛细胞中bMx1/bMx2的诱导情况，并通过过表达、敲低和诱变方法评估了其抗病毒活性。与气管细胞相比，bMx1和bMx2在乳腺细胞中的诱导均更强。bMx1（而非bMx2）的过表达显著抑制了季节性甲型流感病毒（IAV）、低致病性和高致病性禽流感病毒（包括H5N1 2.3.4.4b），但不抑制乙型流感病毒。相反，敲低bMx1导致IAV生长增强。此外，bMx1抑制病毒复制的早期阶段，作用于减少病毒转录及病毒复制周期中的后续步骤。已知降低人MxA（hMxA）活性的突变也损害了bMx1功能，而与hMxA耐药性相关的病毒核蛋白（NP）突变同样降低了病毒对bMx1的敏感性。进一步地，系统发育分析显示，少数（>0.03%）禽源H5N1 2.3.4.4b病毒已携带其中一些NP突变。这些发现表明，尽管当前的H5N1病毒总体上仍对bMx1敏感，但病毒进化或机会性重配可能驱动Mx耐药性并增加大流行风险。

论文解读文章

研究背景与科学问题

自2020年以来，高致病性禽流感（HPAI）H5N1分支2.3.4.4b病毒以前所未有的规模感染野生鸟类，并在家禽中造成大规模死亡，同时外溢感染超过60种哺乳动物。2024年，该病毒首次在美国德克萨斯州的奶牛中被检测到，并已扩散至17个州的多个牧场，对受感染动物的产奶量造成重大影响。截至2025年8月1日，已有超过41例人类H5N1 2.3.4.4b感染病例在与奶牛群接触后被报告。这种病毒入侵奶牛这一具有农业重要性的哺乳动物物种，引发了对其大流行威胁的高度关注。

此前，奶牛被认为是甲型流感病毒（IAV）的非典型宿主，仅有零星感染报道。然而，当前疫情中奶牛表现出更严重的临床症状，包括乳腺炎、采食量减少和产奶量下降，并且存在明确的牛传牛传播证据。研究表明，乳腺上皮细胞是大多数奶牛中H5N1 2.3.4.4b感染的主要部位，受感染动物乳汁中病毒滴度可高达10¹⁰ TCID₅₀/mL。

在宿主抗病毒防御方面，黏病毒抗性（Mx）蛋白是干扰素刺激基因（ISG）编码的关键抗病毒效应分子。人MxA（hMxA）对禽源IAV具有强效抗病毒活性，被视为限制禽流感病毒向人类引入的种间屏障。然而，历史上引起大流行的病毒已通过在核蛋白（NP）中获得特定氨基酸替换而降低了对hMxA的敏感性。鉴于奶牛正成为H5N1病毒持续循环的新哺乳动物宿主，阐明牛Mx蛋白（bMx1和bMx2）的抗病毒功能及其与hMxA的相似性，对于评估大流行风险至关重要。

研究目的与主要结论

本研究旨在系统表征bMx1和bMx2蛋白，探讨其对不同亚型IAV（包括人源季节性毒株、低致病性禽流感（LPAI）病毒和高致病性H5N1分支2.3.4.4b病毒）的抗病毒活性，并比较其与hMxA在作用机制和病毒识别上的异同。研究得出以下核心结论：（1）bMx1（而非bMx2）对所有测试的IAV亚型均表现出显著抗病毒活性，但对禽源病毒的作用强于人源病毒；（2）bMx1通过抑制病毒基因组复制、mRNA转录和病毒蛋白合成发挥抗病毒作用；（3）bMx1的功能关键残基及其与hMxA相似的NP识别模式表明两者具有高度功能保守性；（4）当前流行的H5N1 2.3.4.4b病毒总体对bMx1敏感，但极少数禽源病毒已携带已知的Mx耐药性相关NP突变。

关键技术方法概述

研究使用了以下关键技术：（1）利用qPCR检测牛肾细胞系（MDBK）和原代分化的奶牛乳腺及气管上皮细胞中bMx1/bMx2的mRNA表达水平；（2）通过慢病毒转导构建强力霉素（Dox）诱导型过表达bMx1、bMx2、hMxA及bMx1突变体的MDBK稳转细胞系；（3）采用流式细胞术和共聚焦显微镜检测蛋白表达定位；（4）通过siRNA介导的基因敲低验证内源性bMx1的抗病毒功能；（5）运用反向遗传学技术（reverse genetics）构建含有特定NP突变的7:1重组病毒（7个基因来自PR8株，1个NP基因来自A/Auckland/01/2009株）；（6）采用微复制子（minireplicon）系统评估病毒聚合酶活性；（7）对GISAID数据库中36,483条HPAI H5N1 2.3.4.4b病毒的NP序列进行生物信息学分析，计算香农熵（Shannon entropy）并评估已知Mx耐药性标记的频率。

研究结果详解

1. 牛Mx蛋白的同源性分析

通过多序列比对确认bMx1和bMx2与绵羊Mx蛋白同源性最高（>90%），与犬、人、猪的同源性亦超过70%。两种蛋白均含有保守的三联GTP结合基序和发动蛋白样基序。牛Mx基因座两侧为TMPRSS2和FAM3B基因，排列方向与人、犬、马、猪和绵羊相似，但与小鼠不同。

2. bMx1和bMx2的表达诱导

在MDBK细胞中，内源性bMx1的本底表达水平显著高于bMx2（约10^?4 vs 10^?6倍于GAPDH）。IFN-α处理后，bMx2的诱导倍数（~12,500倍）远高于bMx1（~570倍），两者均在6小时达峰。IAV（HKx31株）感染后，两种基因在24小时达到更高诱导水平，bMx2的诱导幅度（~450倍）仍大于bMx1（~30倍）。

3. Dox诱导过表达系统的建立

成功构建了Dox诱导型过表达FLAG标签融合bMx1或bMx2的MDBK细胞系。诱导后bMx1和bMx2的mRNA水平在6小时内快速上升并维持至24小时，其上调幅度与IFN-α处理内源基因的水平相当。共聚焦显微镜证实两种蛋白均定位于细胞质，其中bMx1呈更为点状的分布模式。

4. bMx1特异性抑制甲型流感病毒

多周期生长实验表明，Dox诱导的bMx1使实验室适应株HKx31（H3N2）滴度降低约45倍，对人源H1N1（Brazil78）和H3N2（Udorn72）分别降低约12倍和10倍。相比之下，bMx2过表达对任何IAV均无抑制作用。两种bMx蛋白均不抑制乙型流感病毒（IBV）。siRNA敲低内源性bMx1后，IAV复制显著增强，尤其在IFN-α预处理的细胞中效果更明显（24小时和48小时分别增加2.6倍和18.6倍），证实了内源性bMx1的重要抗病毒作用。

5. bMx1抑制病毒转录与基因组复制

在感染后8小时，bMx1过表达使NP⁺、M⁺和HA⁺细胞的百分比显著降低，且NP和HA阳性细胞的几何平均荧光强度（gMFI）也下降。定量PCR显示，NP的mRNA和vRNA拷贝数分别减少了23倍和7倍，而M基因的变化不显著。微复制子实验进一步证明bMx1可将病毒聚合酶活性降低50%以上，效力强于hMxA。

6. bMx1抗病毒活性的关键残基鉴定

通过定点诱变发现，hMxA中破坏活性的L41A和T103A突变（对应bMx1的L30A和T92A）完全消除了bMx1的抗IAV活性，并导致蛋白形成异常的核周聚集。L612K突变（对应bMx1的L598K）同样使bMx1丧失活性，这与hMxA不同但类似于小鼠Mx1。Y561位点的芳香族残基（Y或F）对bMx1活性有增强作用但非必需（Y561A仍有约3倍抑制效果）。这些结果表明bMx1在作用机制上更接近小鼠Mx1而非hMxA。

7. NP突变对bMx1限制作用的调控

将H1N1pdm09病毒NP中与hMxA耐药相关的三个突变（D53E、I100R、V313F）逆向引入A/Auckland/01/2009病毒后，重组病毒对bMx1和hMxA的敏感性均显著增强。在bMx1过表达条件下，突变病毒（MUT）的NP⁺细胞比例和病毒滴度较野生型（WT）病毒降低更多。siRNA敲低实验同样证实，内源性bMx1对MUT病毒的抑制效果强于WT病毒，证明bMx1和hMxA识别相同的NP决定簇。

8. LPAI对bMx1的高度敏感性

测试了涵盖13种不同亚型的LPAI病毒，所有病毒在bMx1过表达时均受到显著抑制（滴度降低12至66倍），而bMx2无此作用。序列分析确认所有LPAI病毒的NP均携带与hMxA高敏感性相关的残基（53E、100R、313F等）。

9. HPAI H5N1 2.3.4.4b病毒诱导bMx表达且对bMx1敏感

在原代分化的奶牛乳腺和气管上皮细胞中，HPAI H5N1 2.3.4.4b病毒（Ohio24株）感染诱导了bMx1和bMx2的表达，且在乳腺细胞中的诱导趋势更强。在MDBK细胞中，bMx1过表达使所有测试的HPAI H5N1病毒（包括禽源的Spoonbill22和牛源的Idaho24、Ohio24）滴度降低超过35倍，其中Spoonbill22最为敏感（>690倍降低）。IFN-α预处理则实现>500倍的抑制效果。

10. H5N1 2.3.4.4b病毒中Mx耐药性相关NP突变的低频分布

对超过3.6万条H5N1 2.3.4.4b病毒NP序列的分析显示，已知的hMxA耐药性标记（如53D、100I/V、283P、313V/Y）在禽源病毒中出现频率极低（均<0.03%），而在牛源、人源和其他哺乳动物来源的病毒中未检出。值得注意的是，在孟加拉国的两株禽源病毒中发现了包含补偿性突变G16D在内的全套耐药标记组合。香农熵分析还揭示H5N1病毒的NP在多个位点（特别是52、105和373位）具有较高变异度，其中52位和105位的变异已被其他研究报道与hMxA敏感性改变相关。

讨论总结与研究意义

本研究系统阐明了牛Mx蛋白的抗流感病毒功能，揭示了bMx1（而非bMx2）是介导抗IAV活性的关键效应分子，其作用机制与hMxA和小鼠Mx1既有相似又有差异。bMx1通过抑制病毒转录和基因组复制发挥作用，其功能依赖于特定的结构域完整性，且病毒NP的特定氨基酸残基是决定其敏感性的关键。研究发现，当前流行的HPAI H5N1 2.3.4.4b病毒总体上仍对bMx1保持高度敏感，这在一定程度上解释了为何该病毒在牛群中尚未获得广泛的人Mx抵抗能力。然而，极少数禽源病毒已携带已知的Mx耐药性NP突变，甚至出现了完整的耐药组合，这构成了潜在的大流行风险。

研究结论指出：鉴于bMx1与hMxA在病毒识别上的高度相似性，H5N1病毒在奶牛中的持续循环可能施加选择性压力，促使产生逃逸bMx1限制的变异株，而这些变异株也可能同时降低对hMxA的敏感性，从而增加其在人类中暴发大流行的潜力。因此，对奶牛中流行的HPAI H5N1 2.3.4.4b病毒进行持续的基因组监测和功能性表征至关重要，特别是关注NP基因中已知和新出现的突变位点。本研究的发现不仅增进了对牛Mx蛋白抗病毒功能的理解，也为评估当前禽流感大流行风险提供了重要的科学依据。