非肌性肌球蛋白重链IIA（氨基酸1831–1882）通过糖蛋白gH与gL相互作用促进伪狂犬病毒入侵的功能分析

《Journal of Virology》：Functional analysis of non-muscle myosin heavy chain IIA (amino acids 1831–1882) in facilitating pseudorabies virus entry via interaction with glycoproteins gH and gL

　　

摘要专业翻译 伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是引起猪伪狂犬病的病原体，给全球养猪业造成重大经济损失。非肌性肌球蛋白重链IIA（Non-muscle myosin heavy chain IIA，NMHC IIA）作为一种肌动蛋白结合运动蛋白，已被认为是疱疹病毒入侵的功能性宿主因子。然而，其在PRV入侵中的精确机制仍不清楚。研究人员的调查表明，使用特异性化学抑制剂、siRNA介导的敲低、NMHC IIA羧基端片段（sPRA，氨基酸1672–1981）或兔抗sPRA血清对NMHC IIA进行靶向抑制，均能以剂量依赖方式显著降低PRV对PK-15细胞的感染。在PRV感染的早期阶段，NMHC IIA从细胞质快速且显著地转位至细胞表面，这有利于病毒入侵。研究确定sPRA通过结合病毒糖蛋白gH和gL介导PRV内化。此外，研究人员将sPRA内跨越氨基酸1831–1882的亚结构域定位为介导与gH/gL相互作用及促进病毒内化的关键结构域。这些结果推进了对NMHC IIA支持PRV感染的分子通路理解，并凸显其作为PRV干预治疗靶点的潜力。

论文解读

一、研究背景与科学问题

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是引起猪伪狂犬病（又称奥耶斯基氏病）的病原体，在全球养猪业中造成巨大经济损失。猪是PRV的唯一自然宿主和储存宿主，感染后表现为神经、呼吸和生殖系统疾病。多种其他哺乳动物（包括啮齿类、猫、狗、牛和狼）也可感染并致死。尽管PRV已在许多西方国家家猪中根除，但在中国仍作为重要病原体流行。PRV属于α疱疹病毒亚科，可在猪体内建立潜伏感染，给通过疫苗根除带来重大挑战。近年来PRV变异株的出现使现有疫苗的防控更加困难。更重要的是，中国近期人类PRV感染病例报告增多，尤其发生在与感染猪或相关产品密切接触的人群中，提示PRV对动物和人类均构成潜在威胁。然而目前尚无有效治疗PRV感染的药物，因此深入理解PRV感染机制对于开发新型治疗和预防策略至关重要。

病毒吸附和入侵是病毒生命周期的起始和关键步骤。与其他α疱疹病毒类似，PRV的吸附和入侵需要多种包膜糖蛋白（gB、gC、gD、gH/gL）与宿主细胞受体或因子的协同作用。尽管已有多种宿主分子被鉴定参与这些过程，但宿主因子的完整谱系及其在PRV吸附和入侵中的确切作用仍未完全阐明。

非肌性肌球蛋白重链IIA（NMHC IIA）是由Myh9基因编码的细胞骨架成分，在哺乳动物中高度保守，参与细胞黏附、极化、迁移和形态发生等多种细胞活动。近年来，NMHC IIA被发现参与多种病毒的内化过程，包括PRRSV、α疱疹病毒（HSV-1和EHV-1）、γ疱疹病毒（KSHV、EBV和MHV-68）、SFTSV、SARS-CoV-2和HPV等。在病毒入侵过程中，正常情况下定位于细胞质的NMHC IIA会重新分布到细胞表面膜以促进病毒感染。尽管NMHC IIA此前已被报道与PRV感染相关，但其在PRV入侵中的具体作用和分子机制仍不清楚。本研究旨在阐明NMHC IIA在PRV入侵中的功能及其分子机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过多种独立方法证实NMHC IIA是PRV高效入侵所需的重要宿主因子。使用特异性化学抑制剂blebbistatin（BBT）抑制NMHC IIA活性、siRNA敲低NMHC IIA表达、可溶性NMHC IIA羧基端片段sPRA（氨基酸1672–1981）竞争性阻断以及兔抗sPRA血清封闭，均能以剂量依赖方式显著降低PRV对PK-15细胞的感染。时间加药实验表明NMHC IIA在PRV感染的早期阶段发挥作用。感染早期观察到NMHC IIA从细胞质快速转位至细胞表面，这一现象对病毒内化至关重要。进一步研究表明，NMHC IIA的羧基端区域sPRA通过与病毒糖蛋白gH和gL相互作用介导PRV内化，但不影响病毒吸附。通过截短片段筛选，研究人员将sPRA内氨基酸1831–1882区域精确定位为介导与gH/gL相互作用和促进病毒内化的关键功能域。删除该区域的NMHC IIA突变体无法转位至细胞膜，也不能与病毒颗粒共定位。这些发现深化了对NMHC IIA参与PRV感染分子机制的理解，并提示NMHC IIA是PRV防控的潜在治疗靶点。

三、主要关键技术方法

研究人员主要运用以下关键技术方法：使用CCK-8试剂盒评估化合物和蛋白片段细胞毒性；采用blebbistatin（BBT）特异性化学抑制NMHC IIA活性；利用siRNA靶向敲低PK-15细胞中NMHC IIA表达；构建全长及截短NMHC IIA重组质粒进行过表达和缺失突变分析；通过大肠杆菌原核表达系统制备sPRA及其截短片段和NMHC IIA^1831–1882重组蛋白；运用免疫荧光分析（IFA）检测病毒感染、吸附和内化；采用Western blot和实时荧光定量PCR（qPCR）检测病毒gB蛋白和mRNA水平；通过TCID₅₀法测定子代病毒滴度；利用细胞表面蛋白生物素化分离试剂盒提取膜蛋白；采用免疫共沉淀（co-IP）和His pull-down实验鉴定蛋白相互作用。细胞系为PK-15和HEK 293T细胞，病毒株为PRV Ea株。

四、研究结果

抑制NMHC IIA活性可降低PRV感染。 使用BBT预处理PK-15细胞后，qPCR和Western blot分析显示PRV gB表达呈剂量依赖性下降，20 μM BBT在MOI为0.01和0.1时分别将病毒感染降低约80%和70%。TCID₅₀检测显示子代病毒滴度分别下降超过100倍和30倍，表明功能性抑制NMHC IIA可有效限制PRV感染。

改变NMHC IIA表达水平影响病毒感染。 siRNA敲低NMHC IIA表达约70%后，PRV gB在mRNA和蛋白水平均显著降低，子代病毒产量在MOI为0.01和0.1时分别减少约100倍和40倍。相反，过表达全长NMHC IIA可显著增强PRV感染，表明NMHC IIA在PRV感染中发挥重要促进作用。

NMHC IIA羧基端结构域（sPRA）与PRV感染相关。 重组sPRA蛋白以剂量依赖方式抑制PRV感染，10 μM时感染降低约70%。兔抗sPRA血清同样以剂量依赖方式降低PRV感染，1:5稀释时抑制率超过70%。对照蛋白和对照血清无抑制作用，表明sPRA特异性参与PRV感染。

PRV感染触发NMHC IIA向细胞膜重新分布。 PRV感染后NMHC IIA总蛋白和mRNA水平无明显变化，但感染早期（温度转换后5–30分钟）NMHC IIA显著从细胞质转位并暴露于细胞表面，该现象可被BBT处理消除。未通透化IFA证实NMHC IIA在细胞表面与PRV颗粒共定位，表明PRV诱导NMHC IIA转位至细胞表面而不影响其总体表达。

sPRA参与PRV内化。 sPRA预处理对病毒吸附无显著影响，但使PRV内化减少约40%。抗sPRA血清同样不影响吸附但使内化减少60%，表明NMHC IIA促进PRV内化而对病毒吸附影响甚微。

sPRA与PRV糖蛋白gH和gL相互作用。 免疫共沉淀实验显示NMHC IIA可与Flag标记的gH和gL共沉淀，但不与gB、gC和gD共沉淀。PRV感染条件下同样验证了NMHC IIA与gH/gL的相互作用。sPRA-Myc与gH-Flag和gL-Flag可相互共沉淀，与gC仅有微弱结合，与gB和gD无结合。IFA证实gH和gL与sPRA显著共定位，表明NMHC IIA羧基端区域主要与病毒糖蛋白gH和gL相互作用。

NMHC IIA氨基酸1831–1882区域对PRV内化至关重要。 将sPRA截短为八个片段进行病毒阻断实验，其中Δ116、C175、C200和C245四个片段显著抑制PRV感染，而C100和氨基端片段无抑制作用。重叠区域分析提示氨基酸1831–1882可能是关键功能域。重组表达的NMHC IIA^1831–1882蛋白可强烈抑制PRV感染和内化。删除氨基酸1831–1882的NMHC IIA突变体（NMHC IIA^{Δ1831–1882}）在病毒入侵时不能转位至细胞膜，也不与病毒颗粒共定位，而过表达全长NMHC IIA则显著促进PRV入侵并出现膜转位和共定位，证实氨基酸1831–1882区域是PRV内化的关键功能域。

氨基酸1831–1882区域也介导与gH和gL的相互作用。 His pull-down实验显示NMHC IIA^1831–1882-His可结合gH和gL，而C100-His对照无此结合。gB、gC和gD与两者均无相互作用。IFA进一步证实gH和gL均能与NMHC IIA^1831–1882共定位，表明该区域同时是PRV内化和结合gH/gL所必需的关键结构域。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，NMHC IIA作为PRV高效入侵所需的宿主因子，在感染早期从细胞质转位至细胞表面，该现象与SARS-CoV-2、HSV-1和EBV等其他病毒的观察一致。研究将猪NMHC IIA羧基端同源区域（sPRA，氨基酸1672–1981）内的52个氨基酸片段（1831–1882）精确定位为促进PRV内化的关键结构域，该区域同时是结合gH和gL所必需的。PRV与EBV类似，利用gH/gL与NMHC IIA之间的相互作用促进病毒入侵。gC与截短sPRA的微弱结合可能源于截短暴露的隐蔽低亲和力位点，而全长NMHC IIA与gC无结合，强调了NMHC IIA与gH/gL复合物生理性相互作用的特异性。研究提出gH/gL-NMHC IIA相互作用可能促进融合孔形成或后续步骤的模型。NMHC IIA在PRV感染中还具有抑制cGAS介导的天然免疫信号通路的免疫抑制作用。猪与人NMHC IIA羧基端序列高度保守（97.4%一致性），提示该机制可能也支持PRV在许可条件下进入人类细胞。

结论：研究证明NMHC IIA在PRV感染中发挥关键作用。NMHC IIA的细胞表面定位是PRV进入PK-15细胞所必需的。PRV利用病毒糖蛋白gH/gL与NMHC IIA羧基端区域的相互作用促进病毒内化。NMHC IIA氨基酸1831–1882区域是介导该过程的关键结构域。NMHC IIA的保守性提示其可能是疱疹病毒或其他病毒的共同靶点，是开发广谱抗病毒策略的候选分子。