日本分离溃疡棒状杆菌的比较基因组学分析

《Microbiology Spectrum》：Comparative genome analysis of Corynebacterium ulcerans isolates obtained in Japan

　　

摘要：溃疡棒状杆菌（Corynebacterium ulcerans）是一种人兽共患病原体，可引起人类感染，其临床表现与白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）引起的感染无法区分。在日本等许多发达国家，犬猫等伴侣动物是C. ulcerans感染的主要来源。迄今为止，研究人员已收集了106株日本临床及家养动物来源的C. ulcerans分离株，以及一个新近分支的物种——拉莫尼棒状杆菌（Corynebacterium ramonii），其中大部分分离自人类和猫。在本研究中，研究人员对来自自身收藏的106株日本分离株以及来自日本国内外的597株已发表分离株进行了全基因组序列的比较分析。日本分离株被分为两个不同的谱系：C. ulcerans和C. ramonii。日本C. ulcerans分离株的多位点序列分型（MLST）呈现出独特的分布模式，其中一种主要型别ST 337占69.0%，这在欧洲非常罕见。除日本外，不同地理区域也观察到不同的MLST模式组成。这些序列型别与编码白喉毒素（tox）基因的溶原性前噬菌体型别相关联，并在一定程度上与特定条件下的毒素产生相关。通过单核苷酸变异（SNV）分析，在某些临床病例中提示存在从动物到人类的传播。

一、研究背景与研究问题

白喉是一种由产毒棒状杆菌引起的严重呼吸道传染病。传统上，白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）被认为是其主要病原体。然而，近年来在发达国家，一种人兽共患病原体——溃疡棒状杆菌（Corynebacterium ulcerans）所致的感染病例数正在上升，甚至在一些国家已超过C. diphtheriae。由于两者引起的临床症状难以区分，世界卫生组织将C. ulcerans感染也归类为“白喉”。C. ulcerans的宿主范围极广，包括猫、狗等伴侣动物以及多种野生动物和家畜，这与宿主仅限于人类的C. diphtheriae形成鲜明对比。在日本，自1999年最后一例C. diphtheriae白喉病例后，2001年至2019年间报告了34例人感染C. ulcerans病例，其中两例死亡，且多数病例与接触伴侣动物（尤其是猫）有关。

尽管欧洲已有大规模C. ulcerans基因组分析报道，但在亚洲尚缺乏此类研究。目前，对于日本境内C. ulcerans分离株的谱系构成、地理分布特征、其与全球其他地区（尤其是欧洲）菌株的进化关系、以及携带白喉毒素（tox）基因的前噬菌体多样性及其与毒素产生的关联等问题，尚未得到系统阐明。因此，开展针对日本C. ulcerans分离株的大规模比较基因组学研究，对于理解该病原体的区域性流行规律、传播动态及公共卫生风险至关重要。

二、研究内容与结论

研究人员对106株日本临床及动物源C. ulcerans分离株进行了全基因组测序，并结合公开数据库中597株国内外（主要为欧洲）分离株的基因组数据，共计703株菌株进行了系统的比较基因组学分析。研究发现，日本分离株可划分为C. ulcerans和C. ramonii两个独立谱系。通过多位点序列分型（MLST）分析，日本C. ulcerans分离株呈现独特的分布模式：ST 337为主导型别，占比高达69.0%，而在欧洲极为罕见；相比之下，欧洲菌株的MLST多样性更高，法国以ST 325、ST 339和ST 331为主。这种显著的地理差异表明地理隔离可能影响了病原体的种群结构。进一步分析显示，ST 337型别与特定的前噬菌体类型（CU-1和CU-2）密切相关，这些前噬菌体携带tox基因。此外，通过单核苷酸变异（SNV）分析，研究人员在9个人类与伴侣动物（主要是猫）的临床聚集性病例中发现了高度同源的菌株（SNV差异不超过5个），为动物向人的跨种传播提供了基因组学证据。本研究首次揭示了亚洲地区C. ulcerans独特的分子流行病学特征，强调了伴侣动物作为传染源的重要性，为全球范围内监测和防控该人兽共患病提供了重要数据。

三、关键技术方法

1. 1.
   样本与数据来源：研究分析了122株日本分离株（来源包括人类38株、猫70株、狗8株、猕猴1株、虎鲸1株、猫居环境3株及未知来源1株）以及来自公共数据库的581株非日本分离株（主要来自法国、比利时、德国和英国）。
2. 2.
   全基因组测序与组装：对106株日本分离株进行Illumina平台双端测序，并使用SKESA软件进行从头组装。
3. 3.
   比较基因组学与系统发育分析：基于核心基因组单核苷酸变异（SNV）构建最大似然系统发育树（IQ-TREE），并进行MLST分型（mlst工具）、前噬菌体鉴定（PhiSpy, PHASTEST）及SNV网络分析（PopART）。
4. 4.
   毒素产量测定：采用Vero细胞毒性试验定量评估各分离株的白喉毒素产量，并通过中和试验确认特异性。

四、研究结果

1. 谱系与地理分布

系统发育分析将703株菌株清晰地分为C. ulcerans和C. ramonii两大支系。日本C. ulcerans分离株在系统发育树上高度聚集，而欧洲分离株则分布更广。MLST分析显示，日本C. ulcerans中ST 337占主导地位（69.0%），其次为ST 325（12.0%）。相反，在欧洲，ST 325、ST 331和ST 339更为常见，而ST 337仅占2.2%。在日本国内，ST 337主要分布于中部至西部地区，ST 325则局限于中北部，而C. ramonii（ST 344）则向西偏移。时间趋势分析显示，ST 337的分离数量在2008-2012年和2016-2022年出现两次高峰，可能与公众和兽医对该病的认知度提高有关。

2. 前噬菌体与插入位点

约90%的日本分离株携带tox基因。基因组分析鉴定了五种前噬菌体类型（CU-1至CU-5）。其中，CU-1和CU-2为完整前噬菌体，几乎仅存在于ST 337型别中，并整合于染色体上argtRNA基因附近的两个相邻附着位点。其他类型如CU-3、CU-4和CU-5为不完整前噬菌体或致病岛（PAI）。值得注意的是，日本分离株中未发现与C. diphtheriae高度同源的前噬菌体类型（CD型），而后者在欧洲菌株中较为常见。此外，还发现了一种CU型和CD型的嵌合前噬菌体（CU-6），暗示两种噬菌体间可能存在重组事件。

3. 病例分析

对9组人-猫/人-狗临床聚集性病例进行SNV分析，结果显示每组内的菌株均为克隆起源，SNV差异不超过5个，这为动物与人之间的跨种传播提供了强有力的基因组证据。这些病例涉及的MLST型别包括ST 337、ST 325、ST 699和ST 344，其地理分布也与前述的区域分布特征一致。

4. 毒素产生

定量毒素检测发现，ST 337型别菌株的毒素产量显著低于ST 325、ST 332和ST 344型别。有趣的是，在ST 337内部，携带CU-2型前噬菌体的菌株毒素产量显著高于携带CU-1型的菌株。此外，少数ST 344（C. ramonii）分离株表现出极高的毒素产量（最高达平均水平的30倍），其tox基因启动子区的回文序列中存在核苷酸替换，这可能影响了dtxR阻遏蛋白的结合，从而导致毒素脱抑制。

五、讨论与结论

本研究揭示了日本C. ulcerans分离株与欧洲菌株在MLST和前噬菌体类型上存在显著的地理差异。日本以ST 337为主导，且其携带的前噬菌体为C. ulcerans特有类型（CU型），而非C. diphtheriae型（CD型）。这种独特的种群结构可能反映了该病原体在日本引入和扩散的历史。虽然猫是主要的分离来源，但这可能部分归因于宠物猫就诊率较高。研究通过SNV分析为伴侣动物向人类传播提供了直接的基因组证据。在毒素产生方面，ST 337普遍为低产毒株，但其仍可导致致命病例，提示即使低水平毒素也具有临床意义。高产的ST 344菌株则为理解tox基因调控提供了新的见解。总之，本研究填补了亚洲地区C. ulcerans大规模基因组分析的空白，强调了全球合作对于全面描绘该病原体地理分布的必要性，并呼吁提高临床医生和兽医对人兽共患白喉的认识。