蝎源抗菌肽BmKDfsin3通过抑制p38信号通路与激活I/III型干扰素应答广谱抑制SFTSV与HSV-1复制的研究

《Microbiology Spectrum》：Inhibitory activity and mechanism of a scorpion-derived peptide BmKDfsin3 against SFTSV and HSV-1

　　

： 抗病毒肽（antiviral peptide）作为抗病毒药物的重要来源，在病毒防治领域具有显著的应用价值与潜力。因此，发现广谱、高效且低毒的抗病毒肽具有重要意义。本研究发现，蝎毒肽BmKDfsin3不仅能浓度依赖性地抑制发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV）的复制，还能在A549细胞中抑制单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus type 1, HSV-1）的复制。抗病毒时相实验（antiviral phase assay）结果表明，BmKDfsin3主要抑制这两种病毒生命周期中的进入后阶段（post-entry stage）。机制研究表明，BmKDfsin3有效抑制了SFTSV和HSV-1感染所诱导的p38活化。此外，研究人员利用poly(I:C)模拟病毒核酸，发现BmKDfsin3通过激活转录因子p52和干扰素调节因子3（IRF3）增强I型和III型干扰素（interferon, IFN）信号通路。重要的是，BmKDfsin3表现出良好的生物安全性，包括低细胞毒性、低溶血活性及低小鼠毒性。总体而言，BmKDfsin3是一种具有良好生物安全性、强效抗病毒活性及广谱抗病毒谱的天然生物活性肽。

论文解读文章：

一、研究背景与问题提出

蝎子是一类具有超过4亿年历史的古老节肢动物，其尾部的毒腺分泌的毒液富含二硫键丰富的多肽，这些多肽具有结构稳定、抗蛋白酶降解等特性，是天然生物活性肽的重要资源库。已有研究表明，部分蝎毒肽具有抗病毒活性。BmKDfsin3是从东亚钳蝎（Mesobuthus martensii）中鉴定出的兼具防御素样与钾通道毒素样结构的独特毒肽，前期研究已证实其可抑制钾通道、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）复制及细菌生长，且其抗HCV活性与p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路密切相关。

目前，SFTSV作为一种高致死率（6%–30%）的RNA病毒，尚无特异性抗病毒药物或疫苗获批，经验性使用的广谱抗病毒药物如利巴韦林疗效存在争议；HSV-1作为一种感染率极高的DNA病毒，虽以阿昔洛韦等核苷类似物为标准疗法，但耐药病毒株的出现限制了其临床应用。因此，开发具有新作用机制的广谱抗病毒药物具有迫切需求。本研究旨在系统阐明BmKDfsin3的广谱抗病毒活性及其分子机制，并评估其生物安全性，为基于蝎毒肽的抗病毒药物研发奠定基础。

二、研究内容与主要结论

研究人员以SFTSV（RNA病毒）和HSV-1（DNA病毒）为模型，在A549细胞中系统评价了BmKDfsin3的抗病毒活性、作用阶段、分子机制及生物安全性。结果表明，BmKDfsin3具有广谱抗病毒活性，其作用机制涉及抑制病毒依赖的p38信号通路与激活宿主I/III型干扰素（IFN）信号通路的双重策略。该研究为单分子多肽通过同时靶向病毒依赖途径与宿主免疫途径实现高效广谱抗病毒提供了新见解，凸显了抗病毒肽在广谱药物设计中的治疗潜力。

三、主要关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：固相合成法合成线性BmKDfsin3并进行体外氧化折叠获得活性肽；利用qPCR和Western blotting检测病毒RNA及蛋白表达水平；采用抗病毒时相实验区分病毒附着、进入/融合及进入后阶段；通过Western blotting检测p38磷酸化水平；利用poly(I:C)模拟病毒双链RNA刺激，结合qPCR检测I/III型IFN及干扰素刺激基因（ISG）表达；通过Western blotting和免疫荧光染色检测p52、p65及IRF3的活化与核转位；采用CCK8法、溶血实验及小鼠急性毒性实验评估生物安全性；利用血清稳定性实验和HPLC分析评估肽的稳定性。SFTSV毒株由武汉大学健康科学学院余学杰教授提供，HSV-1 F株由福建医科大学基础医学院郑春福教授提供。

四、研究结果

1. BmKDfsin3是来源于蝎毒的非线性螺旋抗病毒肽

BmKDfsin3由38个氨基酸残基组成，含6个半胱氨酸，形成3对二硫键（连接方式为Cys1-Cys4、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6）。与其他蝎源抗病毒肽BmKDfsin4、Smp76和Ev37相比，该二硫键连接方式高度保守。三级结构分析显示，这4种肽均同时含有α-螺旋和β-折叠结构，表明BmKDfsin3是一种结构上呈非线性螺旋特征的蝎毒抗病毒肽。

2. BmKDfsin3浓度依赖性地抑制RNA病毒SFTSV在进入后阶段的复制

在A549细胞中，BmKDfsin3以浓度依赖性方式抑制SFTSV RNA积累和核衣壳蛋白（NP）表达，2.5、5和10 μM浓度下NP蛋白表达分别被抑制48%、49%和58%，估算半数抑制浓度（IC₅₀）为4.63 ± 1.13 μM。抗病毒时相实验表明，BmKDfsin3对SFTSV的附着和进入/融合阶段无影响，但显著抑制进入后阶段（抑制率39%），且不影响游离SFTSV病毒粒子的感染性。

3. BmKDfsin3在HSV-1生命周期多个步骤中抑制DNA病毒复制

BmKDfsin3以浓度依赖性方式抑制HSV-1 RNA水平和ICP0蛋白表达，1.25、2.5、5和10 μM浓度下ICP0蛋白分别被抑制15%、59%、86%和99%，蛋白水平IC₅₀为2.13 ± 1.05 μM。时相实验显示，BmKDfsin3对病毒进入/融合阶段影响微弱，但显著抑制附着阶段（39%）和进入后阶段（48%），并使游离HSV-1病毒粒子感染性降低23%。

4. BmKDfsin3抑制SFTSV或HSV-1感染诱导的p38 MAPK活化

免疫印迹分析显示，2.5、5和10 μM BmKDfsin3处理可显著降低SFTSV和HSV-1感染诱导的p38磷酸化水平，P-p38/p38比值分别被抑制35%、34%、42%和32%、54%、52%。在无病毒刺激条件下，BmKDfsin3不改变基础p38磷酸化水平。这表明BmKDfsin3特异性阻断病毒感染诱导的p38活化，而非非特异性抑制p38基础活性。

5. BmKDfsin3增强I型和III型干扰素信号通路

利用poly(I:C)模拟病毒双链RNA刺激A549细胞后，20 μM BmKDfsin3可进一步增强poly(I:C)诱导的IFN-α1、IFN-β和IFN-λ1表达，并促进下游干扰素刺激基因（ISG）IFITM3、Mx1和OAS1的转录。机制分析显示，BmKDfsin3不改变p65及其磷酸化水平，但显著增加p52蛋白水平并促进其核转位，同时增强IRF3磷酸化。这表明BmKDfsin3通过激活非经典NF-κB通路（p52）和IRF3来增强IFN表达。

6. BmKDfsin3表现出低细胞毒性、低溶血活性和低小鼠急性毒性

CCK8实验显示，BmKDfsin3在高达160 μM浓度下对A549细胞几乎无毒性，对人角膜上皮细胞（HCEC）和Vero细胞的半数细胞毒性浓度（CC₅₀）分别为265.7 ± 1.107 μM和114.8 ± 1.103 μM。在160 μM浓度下，BmKDfsin3对人红细胞的溶血率仅为3.2%。小鼠腹腔注射8 mg/kg BmKDfsin3后，5天内小鼠存活率和体重均未受影响。血清稳定性实验和HPLC分析显示，BmKDfsin3在10%胎牛血清中孵育30小时后仍保持结构完整。

五、讨论与结论

本研究揭示了BmKDfsin3广谱抗病毒活性的双重机制：一方面，BmKDfsin3通过抑制病毒劫持的p38 MAPK信号通路限制病毒复制；另一方面，通过激活转录因子p52和IRF3增强I型和III型IFN信号通路，促进宿主固有免疫应答。这种“抑制病毒依赖途径”与“激活宿主免疫”的协同作用，赋予BmKDfsin3对系统发育上差异显著的RNA病毒（SFTSV）和DNA病毒（HSV-1）均具有显著的剂量依赖性抑制活性。值得注意的是，pull-down实验表明BmKDfsin3并不直接与p38或MKK3/6结合，其对p38磷酸化的抑制可能通过上游调控因子介导，具体靶点有待进一步鉴定。此外，BmKDfsin3对游离SFTSV病毒粒子无直接灭活作用，可能与其包膜上致密的Gn/Gc糖蛋白 lattice结构阻碍肽段接近有关。研究人员指出，目前机制研究主要基于poly(I:C)模拟RNA病毒核酸刺激，BmKDfsin3对DNA病毒（如HSV-1）感染中DNA感知通路（如cGAS-STING）的具体影响尚不明确，有待后续研究。总体而言，BmKDfsin3作为一种来源于蝎毒的天然生物活性肽，兼具良好的生物安全性、强效抗病毒活性和广谱抗病毒谱，其通过同时靶向病毒依赖途径与宿主免疫途径实现高效抗病毒的作用模式，为广谱抗病毒药物设计提供了新思路和新候选分子。