AAV编码的CaV3.2肽适体用于外周靶向疼痛治疗的临床前持续镇痛与转化潜力

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Preclinical sustained analgesia and translational potential of AAV-encoded CaV3.2 peptide aptamers for peripherally targeted pain therapy

　　

研究人员既往鉴定出两种钙通道3.2（CaV_3.2）抑制性肽适体（3.2iPA1和3.2iPA2），用于腺相关病毒（AAV）介导的感觉神经元靶向镇痛，并在大鼠疼痛模型中进行了验证。本研究通过评估其在人类感觉神经元中的作用，探讨了AAV-CaV_3.2iPAs的长期临床前镇痛疗效及转化潜力。研究人员构建了AAV6.2FF编码的串联体3.2iPA（Co3.2iPA），由3.2iPA1和3.2iPA2串联组成。通过将AAV6.2FF-Co3.2iPA注射至胫神经损伤（TNI）诱导的疼痛性神经病大鼠的腰背根神经节（DRG），评估其镇痛疗效。结果显示，在4个月观察期内，疼痛行为得到缓解，且雄性与雌性TNI大鼠的缓解幅度和时间进程相当。免疫组化（IHC）和AAV基因组分析证实了Co3.2iPA的外周神经限制性生物分布及长期转基因表达。Co3.2iPA可抑制人类感觉神经元中的T型钙通道，并抑制动作电位发放，这支持了将AAV6.2FF-Co3.2iPA递送至DRG用于治疗对现有疗法耐药的难治性慢性疼痛的转化潜力。

慢性神经病理性疼痛是临床治疗的重大挑战。尽管中枢神经系统（CNS）是痛觉意识所必需，但外周感觉神经元（PSNs）的过度兴奋既足以启动也能维持神经病理性疼痛。T型钙通道/CaV_3.2在PSNs中的上调是多种疼痛状态的重要分子驱动因素。研究人员前期已鉴定出两种CaV_3.2抑制性肽适体（3.2iPA1和3.2iPA2），并可经腺相关病毒（AAV）递送至感觉神经元，在大鼠疼痛模型中产生镇痛效应。然而，AAV递送的CaV_3.2iPAs能否在外周感觉通路中持续表达并提供长期镇痛，以及能否抑制人类感觉神经元中的T型钙通道，尚待确证。此外，人类背根神经节（DRG）感觉神经元不易获得，而人类诱导多能干细胞来源的感觉神经元（hiPSC-SNs）模型为转化研究提供了重要工具。因此，本研究旨在评估AAV编码的串联体Co3.2iPA的长期镇痛效果及其转化潜力。

该研究首先通过GFP亲和pull-down和质谱分析，验证了3.2iPA1和3.2iPA2能够结合全长CaV_3.2蛋白。随后在胫神经损伤（TNI）模型动物中证实，DRG单次注射AAV6.2FF-Co3.2iPA可在至少4个月内显著缓解机械性、热、冷和伤害性机械刺激诱发的疼痛行为，并减轻自发性疼痛的情绪情感成分，且雄性和雌性大鼠疗效相当。同时，AAV基因组主要局限于注射侧DRG及外周感觉通路，转基因在感觉神经元中长期表达。在人类感觉神经元模型中，Co3.2iPA选择性抑制T型钙通道电流并降低动作电位发放频率，而不影响其他电压门控通道。这些结果支持将该策略应用于难治性慢性疼痛的转化潜力。

关键方法包括：使用TNI模型，在L4/L5 DRG内微注射AAV6.2FF载体；行为学测试（von Frey、pin、丙酮、热刺激）和加巴喷丁（GBP）诱导的条件位置偏好（CPP）评估；免疫组化（IHC）和定量PCR（qPCR）检测AAV基因组分布；GFP亲和pull-down联合银染、免疫印迹和纳升反相液相色谱-串联质谱（nLC-MS/MS）验证蛋白相互作用；PIP strip脂质结合实验；全细胞膜片钳记录HEK3.2细胞、hiPSC-SNs和人类DRG感觉神经元（h-SNs）的离子通道电流与动作电位。hiPSC-SNs购自Anatomic（来源于女性人类神经嵴干细胞），h-SNs来自3名男性供体（Anabios，死因均为头部创伤）。

研究结果如下。

确认3.2iPA-CaV3.2相互作用是3.2iPA作用的潜在机制：通过GFP亲和pull-down和nLC-MS/MS，在HEK3.2细胞中检测到3.2iPA1/2与全长CaV_3.2蛋白结合，提示二者可能通过结合CaV_3.2蛋白的不同位点抑制通道激活。

治疗性AAV基因产物设计：构建了Co3.2iPA（3.2iPA1和3.2iPA2串联，GFP融合），在HEK3.2细胞中Co3.2iPA抑制CaV_3.2电流约67%，而对照Co3.2NP无抑制；Co3.2iPA还通过多价静电作用结合磷脂酰肌醇磷酸（PIPs）。

雄性TNI大鼠DRG递送AAV6.2FF-Co3.2iPA后的持续镇痛：实验设计包括TNI后2周建立痛觉过敏，随后单次DRG注射AAV6.2FF-Co3.2iPA或对照。行为学评估显示，治疗组在3.5个月内对机械、热、冷和伤害性机械刺激的疼痛行为分别平均降低52%、49%、69%和67%；CPP实验表明治疗组对GBP配对侧偏好显著增加，提示自发痛得到缓解。

AAV生物分布与体内感觉神经元转导：qPCR检测显示AAV基因组主要存在于注射同侧DRG和腰脊髓，其他组织和体液中低于检测阈值；IHC显示约45%感觉神经元转导表达GFP-Co3.2iPA，且主要限于神经元胞质、核和质膜，不表达于神经胶质细胞。

雌性TNI大鼠DRG-AAV6.2FF-Co3.2iPA治疗的镇痛作用：雌性大鼠表现出与雄性相似的表型，治疗后机械和热痛超敏及GBP-CPP均恢复正常，平均反转率为53%、49%、59%和70%，IHC显示48%±6%感觉神经元转导，提示无性别差异。

Co3.2iPA对人工培养的人类感觉神经元T通道电发生的影响：在hiPSC-SNs中，LV-Co3.2iPA转导后几乎100%细胞表达GFP，电生理记录显示T型钙电流显著抑制，动作电位发放减少，但不影响其他通道；在h-SNs中同样观察到T型电流抑制和动作电位发放频率降低。

讨论部分指出，PSN-T型钙通道是动态调控的关键靶点，Co3.2iPA可能通过多种机制（如干扰USP5-CaV_3.2相互作用、模拟自身抑制、影响蛋白激酶C磷酸化等）发挥作用。鉴于DRG注射的临床可行性，该策略具有较好的转化前景。局限性包括未评估AAV衣壳特异性体液免疫、核定位Co3.2iPA的潜在效应等。研究结论为：本研究结果凸显了AAV6.2FF-Co3.2iPA在外周靶向疼痛治疗中的潜力。虽然已证实Co3.2iPA抑制感觉神经元兴奋性不涉及钠通道、BK钾通道和高压激活钙通道，但仍不能排除其与未知靶点相互作用；AAV基因组的长期存在可能提示免疫原性较低，但未经实验证实；核定位的Co3.2iPA是否影响转录组和神经元毒性仍未知。因此，需要进一步研究来解决这些局限性。