噬菌体编码蛋白PciP通过CheV依赖性与非依赖性机制差异调控铜绿假单胞菌群集运动及群体感应相关表型

《mSphere》：Phage-encoded PciP differentially regulates Pseudomonas aeruginosa swarming motility and quorum-sensing-associated phenotypes via CheV-dependent and CheV-independent mechanisms

　　

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种机会性病原菌，其固有抗生素耐药性及复杂的毒力调控网络构成重大临床挑战。噬菌体及其编码蛋白已成为细菌生理的潜在调节因子，然而噬菌体蛋白影响细菌毒力的机制尚不清楚。本研究鉴定出PciP，一种由裂解性噬菌体PAYQ66编码的早期蛋白，可抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素（pyocyanin）产生与群集运动（swarming motility）。PciP降低PQS水平并抑制群体感应（quorum-sensing, QS）基因转录。PciP与CheV结合，遗传学分析表明CheV为PciP介导的群集运动抑制所必需，但非PciP介导的PQS及绿脓菌素产生抑制所必需。PciP的表达可减弱感染模型中的毒力。综上，这些发现揭示PciP通过CheV依赖性与CheV非依赖性机制差异调控群集运动及群体感应相关表型。上述结果为噬菌体编码蛋白如何重编程宿主调控网络提供了机制性见解。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰阴性机会性病原菌，广泛分布于自然环境与医疗相关环境，可引发多种感染，尤其多见于免疫功能低下患者，并具有多种固有抗生素耐药机制，且能通过基因突变和水平基因转移快速获得额外耐药性。其适应多样环境的能力与生物膜形成、表面黏附及运动性相关，运动行为包括鞭毛依赖的泳动（swimming）、IV型菌毛依赖的蹭行运动（twitching）以及受鞭毛、IV型菌毛、表面活性剂、群体感应（quorum sensing, QS）和环境条件等多因素影响的群集运动（swarming）。多重耐药、广泛耐药乃至泛耐药菌株不断出现，使铜绿假单胞菌成为细菌感染管理中的持续难题。噬菌体是感染细菌并依赖宿主细胞过程进行复制的病毒，感染过程中噬菌体编码蛋白可与参与转录、翻译、代谢及抗噬菌体防御的宿主组分相互作用。在铜绿假单胞菌中，早期噬菌体蛋白ΦKZ014与宿主核糖体相互作用并参与噬菌体介导的宿主蛋白合成控制；裂解性假单胞菌噬菌体LMA2编码的PIT2与QS调控因子LasR相互作用并影响QS及毒力相关表型；PaoP5噬菌体蛋白Dap1与c-di-GMP磷酸二酯酶相互作用，改变胞内c-di-GMP水平并影响细菌运动性与生物膜形成；裂解性假单胞菌噬菌体编码的Gp21影响QS及IV型菌毛形成并改变噬菌体吸附。噬菌体感染亦可改变铜绿假单胞菌的QS信号，而宿主的QS状态可影响噬菌体感染。这些观察提示噬菌体编码蛋白可能通过靶向宿主调控过程影响细菌行为，但裂解性噬菌体早期蛋白如何与宿主运动调控通路相互作用、以及此类相互作用是否与QS和毒力相关联仍不清楚。本研究对PciP（phage-encoded CheV inhibitory protein，噬菌体编码CheV抑制蛋白）进行了功能表征，其为裂解性噬菌体PAYQ66编码的早期蛋白。PciP与铜绿假单胞菌趋化相关蛋白CheV相互作用并影响群集运动，CheV共表达可减轻PciP所致的群集运动缺陷；PciP亦以不依赖CheV的方式降低QS信号及绿脓菌素产生；与上述调控效应一致，PciP表达显著减弱铜绿假单胞菌在动物和植物感染模型中的毒力。这些发现将PciP鉴定为铜绿假单胞菌运动性与QS的噬菌体编码调控蛋白，并支持噬菌体编码蛋白在细菌毒力调控中的作用。

在技术方法层面，研究人员主要采用：以裂解性噬菌体PAYQ66按感染复数（MOI）10感染指数期铜绿假单胞菌，于感染后1、5、15、30 min取样，经总RNA提取、DNase I处理及逆转录后行实时定量PCR（qPCR），以预测的噬菌体衣壳蛋白基因orf18为内参、采用2^?ΔΔCt法分析pciP时序转录；采用Flag亲和捕获结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）筛选PciP互作宿主蛋白，并以GST pull-down、共纯化及绿色荧光蛋白（GFP）/mCherry荧光共定位进行验证；通过同源重组构建ΔcheV突变体，利用pHB20T-cheV与pME6032-pciP共表达体系开展遗传学分析；采用lux报告基因融合测定启动子活性，并结合群集运动、泳动、蹭行运动、绿脓菌素、PQS薄层色谱、鼠李糖脂、生物膜及弹性蛋白酶等表型实验；利用大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫与白菜茎秆感染模型评价毒力。研究所用菌株与质粒信息见补充表格。

研究结果如下。

PciP抑制铜绿假单胞菌绿脓菌素产生与群集运动。研究人员通过qPCR检测感染后不同时间点pciP转录水平，证实pciP为感染早期表达基因；将pciP连同天然启动子克隆至pAK1900表达后，群集运动与绿脓菌素产生均降至对照约25%；将pciP克隆至高表达质粒pME6032诱导表达，得到与天然启动子表达一致的群集运动及绿脓菌素抑制表型，且不显著改变OD₆₀₀生长曲线；pciP过表达未显著改变弹性蛋白酶活性、鼠李糖脂产生、生物膜形成、蹭行运动及泳动；过表达pciP显著降低可提取PQS水平。上述结果表明pciP表达抑制铜绿假单胞菌群集运动并降低PQS与绿脓菌素水平。

PciP与CheV蛋白相互作用。序列分析显示PciP无已知结构或功能注释，AlphaFold与Foldseek均未鉴定出可信的结构同源物；研究人员以PciP-Flag融合蛋白从铜绿假单胞菌裂解液中捕获蛋白并经LC-MS/MS分析，依据质谱鉴定评分及其与PciP相关表型的相关性，选择运动相关蛋白CheV进一步分析；PciP-GFP保留对群集运动、PQS及绿脓菌素的作用，共定位分析显示PciP-GFP与CheV-mCherry单独表达时均呈极性富集，共表达时部分细胞中可见极性信号部分重叠；在大肠杆菌中共表达GST-PciP与His-CheV并经Ni-NTA亲和纯化，GST-PciP随His-CheV共纯化；体外GST pull-down中，His-CheV见于GST-PciP洗脱组分而不见于GST对照，支持二者在限定体外条件下的直接相互作用。综上，蛋白质组学筛选与生化实验支持PciP与CheV间稳定相互作用。

CheV选择性介导PciP对群集运动而非绿脓菌素或PQS产生的作用。在PAO1中，PciP表达伴随群集运动降低，而CheV共表达可恢复该表型；在ΔcheV突变体背景中，PciP表达所致的群集运动表型与ΔcheV突变体自身相似，未能重现PAO1中PciP相关变化，表明在所测条件下PciP介导的群集运动改变严格依赖CheV。采用相同共表达体系检测QS相关表型，PAO1中PciP表达降低绿脓菌素产生，CheV共表达未明显改变PciP相关的绿脓菌素与PQS水平下降；在ΔcheV背景中，PciP表达仍伴随PQS与绿脓菌素水平降低，效应方向与幅度与PAO1中大致相当，表明在所测条件下PciP对PQS与绿脓菌素产生的作用在缺乏CheV时仍可检出。此外，单独过表达CheV未明显改变所检测的QS相关基因表达。上述结果提示PciP相关不同表型对CheV的遗传依赖性不同，呈表型特异性关联，其分子基础尚待确定。

PciP抑制铜绿假单胞菌QS基因表达。鉴于PciP以不依赖CheV的方式降低可提取PQS水平，研究人员检测了PciP对QS相关基因表达的影响：PciP表达降低绿脓菌素生物合成基因phzA1与phzA2的启动子活性，降低PQS生物合成操纵子首个基因pqsA的启动子活性；lux报告基因实验显示PciP表达降低lasR、rhlR与pqsR的启动子活性。在CheV过表达条件下，所检测QS相关基因启动子活性未见明显变化，进一步表明单独升高CheV水平不足以显著改变所检测的QS相关基因表达。综上，PciP以不依赖CheV的方式抑制QS相关基因表达与PQS产生，其影响QS网络的具体分子靶点尚待确定。

PciP在动物与植物感染模型中减弱铜绿假单胞菌毒力。研究人员首先采用大蜡螟感染模型，与对照菌株感染的幼虫相比，PciP过表达菌株感染的幼虫存活显著延长、死亡率降低；进而采用白菜茎秆感染模型，对照菌株感染的叶片出现典型软腐症状，而PciP过表达菌株感染的叶片病斑面积明显减小、组织损伤减轻。上述发现表明PciP减弱细菌毒力。据此，研究人员提出假说模型：噬菌体PAYQ66感染铜绿假单胞菌后，早期噬菌体基因pciP表达；PciP直接与细菌趋化蛋白CheV相互作用从而抑制运动性，同时以不依赖CheV的方式间接抑制QS系统，导致PQS产生减少并进而抑制绿脓菌素生物合成，双重作用共同减弱铜绿假单胞菌毒力。

讨论部分指出，噬菌体可通过编码靶向调控、信号或表面相关功能的蛋白重塑细菌生理；在铜绿假单胞菌中，噬菌体蛋白已被证明可干扰QS、双组分信号、IV型菌毛、脂多糖及毒力相关通路，PciP为这一不断扩展的群体增添了独特实例——其并非造成细菌生理的普遍缺陷，而是选择性影响群集运动及若干QS相关输出，且对CheV的依赖性不同。群集运动表型的CheV依赖性得到互补遗传实验支持：PciP降低PAO1群集运动，CheV共表达恢复该表型，而ΔcheV中未观察到PciP相关的额外群集运动降低；相反，cheV缺失后PciP仍降低PQS与绿脓菌素产生，故在所测条件下CheV为PciP相关群集运动表型所必需，而非所测QS相关效应所必需。体外互作实验检测到PciP与CheV共同存在，且PciP在ΔcheV中仍保持极性定位，表明CheV并非PciP定位所必需；该表型有别于直接与多个组氨酸激酶相互作用并广泛影响双组分系统（TCS）依赖性运动性的噬菌体蛋白PIT4，本研究数据支持PciP在群集运动中与CheV相关的作用，但未界定下游信号机制。ΔcheV中PciP相关群集运动额外表型的丧失可能反映cheV缺失后信号背景的改变，包括另一CheW样偶联蛋白的可能补偿；CheV含CheW样偶联结构域，CheW家族蛋白参与化学感受信号，但该可能性尚未检验，不应视为已确立机制。值得注意的是，PciP表型未伴随普遍运动缺陷，泳动、蹭行运动及鞭毛数目未见明显改变。PciP亦以不依赖CheV的方式影响PQS、绿脓菌素及若干QS相关转录输出，这使其区别于直接作用于经典QS组分或PQS生物合成酶的噬菌体蛋白；该PciP相关QS分支的具体宿主靶点仍未知。表型的选择性还得到鼠李糖脂产生、胞外蛋白酶活性及生物膜形成无可检测变化的支持；此类差异与Las、Rhl及pqs系统相互关联的多层调控相一致，其中下游输出并非仅由调控因子转录本丰度决定，还可依赖PqsE等附加因子。噬菌体蛋白亦可经由与QS无关的机制影响细菌表型，例如LKA1尾刺蛋白降解脂多糖O特异性抗原并改变生物膜与毒力表型，PavP影响多种运动状态、生物膜形成及III型分泌系统（T3SS）表达，PaoP5蛋白Dap2同时靶向T3SS调控因子ExsA与Lon蛋白酶，将细菌毒力调控与噬菌体抗防御相联系；与之相比，PciP未可测量地改变所测两种噬菌体的重复感染，表明此处表征的表型未伴随对上述噬菌体易感性的可检测变化。总体而言，PciP界定了噬菌体介导宿主调控的一种独特模式：在所测条件下其对群集运动的作用依赖CheV，而对部分QS相关输出的作用不依赖CheV；PciP-CheV关系提供了噬菌体蛋白可影响宿主运动相关信号组分而不产生普遍运动缺陷的证据，而CheV非依赖性QS相关效应的分子基础仍未阐明。结合靶向信号、表面结构、毒力及抗噬菌体防御的噬菌体蛋白日益增长的多样性，上述发现支持将噬菌体蛋白视为模块化宿主重编程因子的更广泛观点。

研究结论可译为：综上，噬菌体PAYQ66感染铜绿假单胞菌后，早期噬菌体基因pciP表达；PciP直接与细菌趋化蛋白CheV相互作用从而抑制运动性，同时以不依赖CheV的方式间接抑制QS系统，导致PQS产生减少并进而抑制绿脓菌素生物合成；基于上述结果，研究人员提出假说模型；双重作用共同减弱铜绿假单胞菌毒力。