基于重复采样的极端海洋热浪暴露下巨藻基因组变化研究

《Scientific Reports》：Genomic changes revealed by repeated sampling of kelp exposed to an extreme marine heatwave

　　

极端气候事件日益被视为强大的进化驱动力，对自然种群施加突发性压力。其中，海洋热浪（MHWs）是生态变化的主要驱动因素，可导致大规模死亡、分布范围迁移和群落重组，尤其是对栖息地形成型巨藻。尽管其生态影响已有充分记录，但基因组层面的后果仍不明确。具体而言，MHWs不仅可诱导种群统计瓶颈，还可能对与耐热性相关的位点施加选择压力，从而改变受影响种群的等位基因频率。本研究利用历史样本，调查了西澳大利亚三个地点16年间（跨越2011年严重MHW）的巨藻Ecklonia radiata（海带目）的时间遗传变化。总体遗传多样性和组成在事件前（2006、2008年）和事件后（2012、2018、2022年）基本保持稳定，可能反映了种群恢复力。然而，一部分位点（包括已知的温度关联位点）在事件后表现出等位基因频率的变化。此外，最强且数量最多的变化发生在MHW生态影响最大的较温暖低纬度地点，可能与MHW驱动的自然选择一致。这些结果表明，MHWs虽未显著改变全基因组多样性，但可能改变与热响应相关的特定基因座的等位基因频率，突显其作为海洋基础物种进化变化的偶发性但强有力驱动因素的作用。

**研究背景与问题** 极端气候事件被认为是强有力的进化力量，海洋热浪（Marine Heatwaves, MHWs）可造成大规模死亡、分布区收缩和群落重组，尤其对栖息地形成型巨藻影响显著。然而，MHWs的生态影响记录充分，其隐藏的遗传影响——如遗传多样性侵蚀和遗传组成变化——却鲜有报道。遗传多样性是种群恢复力、适应能力和长期存续的基础，因此是评估MHWs持久后果的重要视角。极端事件可通过死亡和定向选择引起强烈遗传变化，剔除适应力较弱的基因型，从而可能提升种群对未来气候胁迫的抵抗力。由于全球极端事件频率和强度预计增加，亟需重复遗传观测以理解其对海洋物种适应能力的影响。但检测和解释此类遗传响应需要能同时捕捉自然背景波动和扰动驱动变化的时间序列数据集。时间遗传数据可揭示等位基因频率变化、遗传多样性降低、种群统计瓶颈及可能的选择信号，这些变化可由遗传漂变、自然选择和迁移等多种过程引起。物种对极端事件的响应预计在其地理范围内存在差异，源于种内遗传多样性、局部适应及事件强度空间异质性的差异。极端事件发生时间和空间的高度异质性使建立稳健的时间遗传研究尤为困难；且多数物种缺乏受影响区域的遗传基线，难以区分自然时间波动与极端事件影响；事件不可预测性还导致采样常为机会性，"事件前"样本往往缺失。在易受MHWs影响的生态系统中，巨藻林尤其脆弱，越来越多证据表明其响应这些事件发生了遗传变化。Ecklonia radiata是澳大利亚大南部礁（Great Southern Reef）的优势栖息地形成型巨藻，既往遗传研究显示其遗传多样性、结构和适应能力存在空间变异，但亦对海温变化高度脆弱，暖域边缘种群对增暖事件尤为敏感。2011年夏季，西澳大利亚超过2,000 km海岸线遭受严重MHW，导致E. radiata在其北部暖域后缘约100 km的分布区收缩，影响在低纬度温暖地点最为显著：暖域边缘Kalbarri的巨藻覆盖完全丧失（从约90%礁覆盖到2011年100%丧失），Jurien Bay（约50%）、Marmion（约25%）和Hamelin Bay（约10%）显著减少，并引发群落组成变化、栖息地可用性降低和生态系统功能改变。Vranken等评估了MHW后西澳约1,000 km范围内的遗传变异，揭示强种群结构、距离隔离及与温度相关的选择信号，包括沿纬度和热梯度变化的温度关联位点，提示对区域热条件的潜在局部适应。Coleman等展示了2006至2018年间推定为中性遗传变异的快照变化，低纬度等位基因频率在MHW后增加，可能与受选择位点的连锁或MHW相关的种群统计过滤有关。但此类前后对比仅提供有限的时间动态视角，这些变化如何转化为全基因组模式（包括暖相关等位基因频率的预期变化）仍不清楚，凸显了需要多采样点和全基因组测序的稳健时间序列以区分短期波动与长期进化响应。为此，研究人员利用2011年MHW影响范围内独特的多年度历史E. radiata样本并结合当代采集，采用全基因组单核苷酸多态性（Single-Nucleotide Polymorphisms, SNPs）评估16年间（MHW前2006、2008年，MHW后2012、2018、2022年）在三个经历不同程度生物量损失地点的基因组多样性和结构的时间变化，检验所有生成位点及既往鉴定的温度关联位点的等位基因频率是否存在时间变化。采样设计允许比较两种变化模型：阈值响应（MHW后遗传变化突然发生）与序列响应（变化随时间逐渐累积）。假设MHW相关的种群下降和再定殖可能通过漂变和迁移影响全基因组遗传变异，温度关联位点可能表现出一致的位点特异性选择响应，且遗传变化幅度随地点而异，生物量损失更大的地点（如Jurien Bay）变化更强。

**关键技术方法** 研究采集西澳Jurien Bay、Marmion和Hamelin Bay三个地点2006、2008、2012年历史标本（整株采集，?20 °C保存）及2022年新鲜材料，并整合2018/2019年已测序原始SNP数据（Vranken等）；采用双酶切限制性位点关联DNA（ddRAD）文库构建，在NovaSeq X平台配对末端150循环测序；使用STACKS进行de novo SNP calling，经VCFtools等严格过滤（最小深度5、最大缺失率10%、MAF>2%、去除连锁不平衡r2>0.2），最终获得322个体18,384个SNPs；通过主坐标分析（PCoA）和sNMF评估种群结构，利用连锁不平衡法估计有效种群大小（Ne），采用约束冗余分析（RDA）识别时间离群位点，并通过BLAST比对提取温度关联位点。

**研究结果** *全基因组种群多样性随时间变化*：所有地点多样性指标在各采样年份保持稳定，Jurien Bay和Marmion平均期望杂合度（HE）最高，Hamelin Bay次之；各地点的HE年际间无显著差异（Monte Carlo检验：Jurien Bay p = 0.406，Marmion p = 0.392，Hamelin Bay p = 0.406）。等位基因丰富度（AR）和核苷酸多样性（π）呈相似趋势。近交系数（FIS）在所有年份和地点持续偏低且略为负值（FIS范围：?0.017至?0.063），均显著偏离零，表明杂合子相对于Hardy–Weinberg期望略有但显著的过剩，无近交证据。*全基因组种群基因组组成随时间变化*：各地点内随时间变化的最优遗传簇数为K = 1，推断种群结构未随时间改变。PCoA支持结构分析，地点内年份无清晰分离，三地点PC1和PC2解释度均低于2.5%；但三地点间在PCoA和结构图中清晰分离。*有效种群大小随时间变化*：Ne在各地点内随时间变化，所有地点Ne最低值出现在MHW期间（2012年）或之后（2018年），随后至2022年回升。该模式在Marmion最明显，最低Ne出现在2012年，与记录的MHW相关生物量损失一致；Jurien Bay和Hamelin Bay最低Ne出现在2018年。Jurien Bay和Hamelin Bay因样本量不足无法获得2012年Ne估计。尽管MHW后下降，Jurien Bay和Marmion的Ne在2018至2022年间大幅增加，提示相对快速的种群统计恢复。研究期间平均Ne亦因地点而异（Jurien Bay = 210.8，Marmion = 264.5，Hamelin Bay = 115.5），但因时间Ne估计受低种群规模时期强烈影响且随样本量变化，应谨慎解读。*单个位点的时间变化*：RDA识别出各地点的随时间变化位点：Jurien Bay（21个SNPs）、Marmion（29个SNPs）和Hamelin Bay（17个SNPs）。仅Jurien Bay和Marmion的位点在RDA中具有显著载荷（Jurien Bay p = 0.029，R2 = 0.001；Marmion p = 0.001，R2 = 0.002），Hamelin Bay载荷不显著（p = 0.240，R2 = 0.004），但从MHW前到后的结构变化在RDA上仍可见。尽管各地点模型解释力较低，Jurien Bay和Marmion的显著结果表明确实可检测到与MHW相关的时间变异。所有地点年份间有清晰分离，尤其是MHW前（2006和2008年）与后（2018和2022年）之间；有趣的是，2012年（MHW刚结束后）样本与MHW前样本聚类。对于温度关联位点（123个SNPs），约半数（44–49%）在各地点内随时间呈单态而被排除，再去除数据不足位点后，Jurien Bay、Marmion和Hamelin Bay分别保留69、76和66个SNPs。所有地点中，大多数发生定向变化的位点（RDA与温度关联位点合并）被归类为随机波动（85.5–97.0%），显示MHW的全基因组效应很小。Jurien Bay有14.4%的位点在MHW期间或之后发生等位基因频率定向变化，其中半数为等位基因的持续丢失；其中两个持续丢失等位基因的位点为Vranken等鉴定的温度关联位点（未被时间RDA检测到），且在北部边缘种群Kalbarri中缺失或MHW前（2006和2008年）缺失，即这些位点在MHW后变得与更北部种群相似。Jurien Bay还有5.8%（仅温度关联位点）出现MHW后等位基因的暂时获得，这些等位基因在更温暖的北部地点Kalbarri更常见，故MHW后这些位点的等位基因频率变得更接近北部种群，但仅限于2012年。Marmion有7.9%的位点显示与MHW相关的变异，多数表现为MHW前后等位基因频率的永久变化，且这些位点仅为时间RDA识别的位点，未在其他地点发现，故无法与其他地点等位基因频率比较。最南部地点Hamelin Bay的RDA位点和温度关联位点时间变化极少，仅3%表现出与MHW相关的等位基因持续丢失；值得注意的是，唯一显示等位基因持续丢失的温度关联SNP所丢失的等位基因在Jurien Bay和Marmion中缺失，意味着MHW后Hamelin Bay该位点的等位基因组成变得更接近北部Marmion和Jurien Bay种群。

**讨论与结论** 本研究揭示西澳三个地点E. radiata在16年间（包括2011年严重MHW）的遗传变化。MHW前后未观察到全基因组遗传多样性和结构变化；相反，在一些已知温度关联位点发现时间变异，MHW暴露前后等位基因频率变化与选择一致。这些位点的等位基因频率变化幅度和时间选择强度反映了MHW的生态影响：在巨藻覆盖生态影响最大的Jurien Bay最显著，在MHW影响较轻的高纬度地点较弱。在可进行多位点比较处，结果与MHW后耐热性选择增强一致：南部（较冷）种群在MHW后等位基因频率向北部（较暖）种群特征偏移，可能指示与变暖驱动选择一致的方向性基因组响应。尽管如此，多数等位基因频率变异随时间呈随机性，可能源于基因流、漂变及非MHW相关环境因素驱动的选择等过程组合；这与既往研究一致，即环境扰动通常仅影响部分位点而非驱动全基因组变化。对于显示潜在MHW相关变化的位点，最强时间偏移出现在MHW刚结束的2012年，提示种群统计扰动和/或环境选择可能促成观察到的遗传模式。部分情况下观察到等位基因频率暂时增加，可能反映来自北部种群等位基因的迁入后恢复至MHW前状态，或对罕见等位基因的选择（因采样有限在其他时间点未检测到）。这与连通性在促进海洋森林扰动后快速遗传周转中的作用一致，即来自连通种群的偶发扩散和补充可在极端事件后暂时改变等位基因频率，随后局部种群统计和选择过程重建扰动前结构。虽不能排除来自Jurien Bay以北与历史Kalbarri种群共享祖先种群的有限等位基因迁入，但时间种群结构分析未发现强迁移输入的证据；这些短暂偏移主要在Kalbarri和Jurien Bay比较中观察到，在更南部种群中未一致检测到。因此，观察到的等位基因频率变化更可能反映对现存遗传变异的选择，可能有利于因采样有限在其他时间点未检测到的罕见耐热等位基因；或这些短期偏移反映巨藻大量死亡后种群统计瓶颈和遗传漂变相关的随机波动。跨地点比较时，模式大体与耐热性选择一致，即向极种群在MHW后变得更接近北部种群。在最北部地点Jurien Bay，14%的多态离群位点显示MHW影响证据，包括两个经历等位基因持续丢失的温度关联位点，提示多样性降低，反映对更耐热等位基因自然选择的结果；这些丢失的等位基因在北部边缘Kalbarri已缺失，而MHW后获得的等位基因在Kalbarri往往常见，与对冷相关等位基因的选择或来自北部的基因流一致。但鉴于Jurien Bay MHW后大量生物量损失和可能的种群统计下降，通过漂变的随机等位基因丢失也可能解释部分观察到的变化。虽RDA检测到与MHW相关的统计显著时间偏移，但相对较小的R2值表明MHW仅解释总体基因组变异的一小部分，与仅影响有限数量位点一致，这在多数位点可能为中性、适应性响应可能涉及相对少数位点的细微等位基因频率变化的情况下是预期的。在中央地点Marmion，随时间变化的多态位点中7%显示与MHW驱动变化一致的变异，其中多数在MHW后等位基因频率发生永久变化（跨越10年），这些位点重要之处在于可能反映对环境变化的位点特异性遗传响应，凸显潜在局部化适应或独特的种群统计过程。相反，最南部地点Hamelin Bay时间RDA位点和温度关联位点变化极少，多数随时间变异与MHW影响不一致。尽管承认巨藻个体和检测到的SNP离群位点样本量有限可能引入一些虚假关联，但暖域边缘存在南部种群变得更接近北部（可能更适应温暖）种群的持续趋势，可能反映耐热性选择。此外，RDA系统性地将MHW识别为驱动所有地点部分位点等位基因频率显著变化的关键时间点；虽效应量小，但跨地点方向性等位基因频率偏移的一致性表明，即使细微基因组变化也可能代表对气候驱动选择的生物学有意义响应。若这些偏移反映对热胁迫的适应性响应，也可能有助于解释北部种群在随后热浪事件中持续存在的原因。例如近期实验研究发现北部E. radiata种群比西澳较冷地区种群表现出更强热耐受性且在高温下总体表现更好；虽本研究无法直接将观察到的基因组变化与种群在后续热浪中的表现联系起来，但2011年极端MHW期间选择增加了耐热基因型频率的可能性，与北部种群在近期较轻变暖事件中观察到的恢复力一致。与预测相反，未发现遗传多样性或结构随时间的重大差异，尤其相对于2011年MHW。由于MHW生态影响随纬度升高而减弱，预期看到与MHW对采样地点遗传多样性和组成影响相镜像的渐变变化。极端死亡可能通过漂变造成强种群统计瓶颈、降低遗传多样性，而随后的再定殖或迁移可能在不必然导致多样性净丧失的情况下改变等位基因频率和遗传组成。此外，观察到的遗传稳定性可由热浪诱导死亡后来自附近遗传相似种群的补充解释，如Vranken等所示恢复中的巨藻林由隐秘幸存者或相邻源种群再定殖，凸显连通性在缓冲极端事件遗传响应中的重要性；该机制也可能促成了MHW后观察到的等位基因暂时获得。鉴于新突变不太可能在如此短时间尺度内出现并增加频率，这些等位基因要么以极低频率存在并在MHW前未被检测到，要么通过来自Jurien Bay以北与历史Kalbarri种群共享祖先种群的迁入引入。虽不能排除来自中间种群的基因流，但时间种群结构分析缺乏强迁移信号提示大规模迁入不太可能；相反，等位基因频率的短暂增加更可能与有限基因流引入潜在暖适应等位基因、随后通过选择增加频率一致。这些等位基因在2012年后的下降或消失可能反映遗传漂变、种群恢复期间局部基因型的种群统计淹没，或环境条件恢复至MHW前状态后对这些等位基因的选择。然而，这些等位基因频率偏移的短暂性提示任何选择优势都是短暂的，或这些等位基因随后通过来自相邻更丰富局部种群的基因流被稀释，导致随后繁殖季节回归MHW前遗传组成。也可能北部相关基因型在MHW后以低频率持续存在但在后期采样中未被检测到。因此，观察到的模式最好由选择与热浪诱导种群下降相关的随机过程的相互作用来解释。观察到的遗传稳定性可能由内在生物学机制强化，如微型配子体的持续存在、休眠"种子库"的补充，或耐受环境扰动的大型孢子体的存活；例如配子体已知比孢子体耐受更长时间的高温，其持续存在可使条件改善后孢子体再生，确保遗传多样性保留。鉴于E. radiata可在约一年内达到生殖成熟，这些机制可能促进扰动后相对快速的种群统计和生态恢复，同时有助于维持跨世代遗传连续性。此外，深水巨藻避难所假说提供另一可能解释：西澳约40 m深的巨藻群落比约15 m浅水群落受2011年MHW影响更小；Minne等近期基因组分析表明西澳深、浅E. radiata种群间存在广泛遗传连通性，几乎没有深度相关遗传分化证据。这些发现表明深水巨藻林与浅水种群良好连接，因而可能作为气候避难所，充当遗传多样性库，能够在扰动后为浅水气候脆弱巨藻林提供种源；这种连通性可促进种群统计恢复，同时有助于维持受影响浅水种群的遗传连续性和多样性。除这些生态机制外，种群统计缓冲也可能起重要作用。巨藻通常种群规模大，可能缓冲其种群在环境扰动期间的遗传变化。尽管时间估计表明采样地点Ne相对较低，真实普查种群大小（Nc）可能大得多；这种种群统计结构可缓冲遗传变化，因为即使每代仅部分个体贡献遗传，大普查数量的持续存在可减少漂变的即时效应。Ne的时间变异也反映了2011年MHW后的种群统计影响及随后的恢复：Marmion在2012年Ne急剧下降，与事件后立即的生物量损失一致，而Jurien Bay和Hamelin Bay在2018年显示类似低的Ne；但Hamelin Bay 2018年估计的低Ne与各项分析中观察到的更广泛遗传稳定性形成对比，提示这些估计应被解读为种群统计变化的相对指标而非种群大小的精确度量。至2022年，所有地点显示种群统计恢复证据，Ne值达到时间序列中最高水平。结合配子体持续存在、隐秘幸存者和深水巨藻避难所的缓冲效应，这些种群统计动态可能提供了互补机制，帮助种群在极端气候扰动下维持遗传完整性，高繁殖力和空间限制的补充动态促进了环境条件改善后的快速再定殖。重要的是，若MHW相关的单世代死亡造成实质性遗传侵蚀，等位基因丰富度降低应出现在期望杂合度明显下降之前，因为种群瓶颈中罕见等位基因通常首先丢失；然而此处观察到的等位基因丰富度相对稳定提示尽管种群统计影响严重，遗传多样性丧失有限。此外，种群瓶颈的遗传后果不仅取决于种群下降幅度，还取决于减少的种群规模持续的世代数，因为杂合性丧失跨世代逐渐累积；因此若干地点观察到的Ne相对快速恢复可能限制了尽管MHW种群统计影响严重但遗传多样性丧失的程度。重要的是，基于LD的Ne估计源自简化代表SNP数据集时应谨慎解读，因其对样本量、过滤阈值和等位基因频率分布敏感，尤其在样本量低时；因此Ne的时间波动可能部分反映方法学不确定性而非仅生物学变化。本研究对巨藻E. radiata提供了种群遗传学时间动态的新见解，特别是展示了极端气候事件（如2011年MHW）如何可能改变海洋基础物种单个等位基因的频率，与定向选择一致。虽部分等位基因频率偏移可能反映适应性响应，但需注意罕见随机等位基因频率波动也可发生，凸显除选择压力外遗传变化的随机性。最终，本研究强调重复遗传观测在理解气候变化影响中的关键作用；通过检测和追踪极端事件的遗传响应，此类监测提供了识别脆弱种群、预测未来适应能力和实施针对性保护策略所需的数据。这些发现进一步表明海洋热浪可能影响基础物种的进化过程，为种群如何响应加速的气候变化步伐提供机制见解；随着海洋热浪频率加剧，此类时间基因组监测很可能被证明具有信息价值，增加在自然种群中留下持久基因组足迹的可能性。