营养调控驱动的鼠李糖乳酪杆菌GG代谢重构及分泌物分析

《mSystems》：Nutrient control enables metabolic reconstruction of Lacticaseibacillus rhamnosus GG and analysis of secretions

　　

鼠李糖乳酪杆菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG，LGG）是一种重要的肠道共生细菌菌株，已在工业与健康领域得到广泛研究。尽管其研究历史较长，但针对LGG的高质量基因组尺度代谢网络模型（genome-scale metabolic network model，GEM）尚未被重构，已发表的仅为自动生成的草稿模型，其功能准确性众所周知较为有限。此外，针对良好控制的体外研究，全面的营养需求尚未建立。本研究呈现了首个针对LGG的经人工审编的GEM，采用了一种新的重构与验证方法，该方法整合了多个自动生成的草稿模型、已应用的研究文献以及高通量明确培养基实验。此外，研究结果还包括一系列化学成分明确培养基、广泛的单组分营养缺失生长数据、来自计算机模拟（in silico）与体外（in vitro）实验关于分泌产物乳酸和吲哚-3-甲醛（indole-3-carboxaldehyde，I3A）的见解、一种最小培养基，以及LGG营养需求的计算机模拟表征。研究人员为开发LGG代谢的跨学科研究工具所采用的方法构成了一个新框架，可应用于许多研究不足的微生物，尤其适用于研究人类微生物组中的细菌。

研究背景：鼠李糖乳酪杆菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG，LGG）自20世纪80年代以来一直是食品微生物学与益生菌开发领域的重要研究对象，已被用于缓解炎症性肠病症状、改善胃肠道副作用以及改善心理健康与神经退行性疾病等方面的研究。LGG可分泌多种对宿主有益的小分子代谢物，并参与与其他肠道微生物群成员的相互作用，例如其发酵主要产物乳酸可作为其他微生物的代谢底物，通过代谢交叉喂养转化为宿主有益的细菌代谢物；LGG自身亦可内源产生吲哚-3-甲醛（indole-3-carboxaldehyde，I3A）等宿主有益代谢物。然而，尽管LGG在基于微生物组的干预中具有重要意义，用于其代谢的机制性与系统性体外（in vitro）和计算机模拟（in silico）研究的关键工具仍然缺乏。在宏基因组学时代，许多被鉴定为重要生物标志物或具有治疗、工业潜力的细菌主要以应用方式进行研究，LGG亦如此，其研究多集中于疾病状态的改善，而这些研究的发现往往未在机制层面得到拓展，导致关于重要细菌的知识状态多具相关性且分散于不同系统与应用之中。若无对LGG代谢的基础性理解，这些转化应用将始终受限。基因组尺度代谢网络模型（genome-scale metabolic network model，GEM）的计算机模拟重构等工具的开发可提供此类基础。传统上，高质量GEM重构在很大程度上是人工的四步过程，需要关于目标生物体的大量生化知识、文献与实验数据，这些要求使得对LGG这类缺乏丰富机制研究的细菌进行GEM审编变得困难。近年来，基于基因组功能注释的自动化方法被开发用于执行其中大部分步骤，并已应用于从人类微生物组中数千个分类单元生成草稿模型，其中一项研究使用了以此方式衍生的LGG GEM。然而，此类自动生成的重构受限于源数据库的完整性、准确性与交叉引用、算法特定的功能校正，以及缺乏通过文献审编、实验验证与模型测试进行的精炼。以往比较七种不同自动化方法的荟萃分析概述了其优势与局限，并建议必须制定领域标准以确保重构的生物学准确性，而不仅仅是功能输出。自动生成的草稿重构预期无法像传统重构、经人工审编的GEM那样完全发挥功能或具备生物学准确性。然而，不断发展的资源景观为进一步改进自动化方法并开发利用实验信息的重构方案提供了机会。以往高质量、经人工审编的GEM严重依赖高通量遗传筛选与突变体文库来实现第四步。对于LGG这类机制研究不足的细菌，遗传工具乃至完全受控的培养方法一直缺乏，这对高质量GEM重构构成挑战。以往LGG的培养方案甚至无法实现完全的营养控制，例如化学成分明确的最小培养基，而为其他生物体开发并应用于LGG的有限工具并未得到广泛使用。使用明确培养基进行营养控制不仅可提高机制性生化与微生物研究的可重复性与严谨性，还可实现高通量体外实验，以提供丰富的代谢表型数据集，类似于突变体文库，用于GEM评估与精炼。此外，在建立营养控制与高质量GEM过程中获得的知识还可提供生物体代谢生态位的系统层面机制定义，该生态位由其环境营养需求与代谢物分泌产物范围所界定。

研究人员开展了以下研究：通过桥接GEM重构的机制框架并在体外与计算机模拟中实现营养控制，广泛拓展了对LGG代谢的理解。本研究引入了一系列营养复杂度不同的LGG化学成分明确培养基、一项高通量单组分缺失实验生长表型筛选、一个名为iGR384的经人工审编的GEM、一种最小培养基及对营养需求及其对生物量组分生产贡献的计算机模拟表征，以及对关键分泌代谢物乳酸和I3A的体外与计算机模拟表征。

研究结论：这些结果为LGG代谢研究提供了新的实用与理论工具，并例证了一个用于重构机制研究深度同样有限的细菌GEM的框架。

重要意义：本研究为理解有益肠道细菌LGG如何生长并与环境相互作用提供了重要基础。尽管LGG是研究最广泛的益生菌之一，用于健康与工业应用，但用于模拟其代谢行为的可靠工具以及对其营养需求的清晰理解仍然缺乏。通过开发首个经人工审编的LGG代谢模型并通过广泛的实验室实验进行验证，本研究提供了关于LGG利用营养与资源的需求与能力的新理解。研究还呈现了完全化学成分明确的生长培养基及相关单组分缺失生长效应，并探索了产生影响人类健康的重要化合物的途径。本研究开发的方法还提供了研究其他表征不足微生物的框架，有助于推进人类微生物组及其在健康与疾病中作用的研究。

关键技术方法：研究人员采用共识方法整合多个独立衍生的自动生成草稿重构（AGORA与MERLIN），通过命名空间映射统一代谢物、反应与基因并合并各自独有组分；基于文献与体外单组分缺失生长表型数据对合并重构进行迭代修剪与添加反应，并以通量平衡分析（flux balance analysis，FBA）进行计算机模拟验证；通过合并三种乳酸菌化学成分明确培养基配方并选取各组分最高浓度构建含52种组分的丰富明确培养基（DM52），经迭代单组分缺失实验衍生DM24、DM16、DM13系列培养基；采用MEMOTE工具评估模型拓扑与注释质量；通过超高效液相色谱-质谱联用（ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）与高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）测定分泌代谢物；并利用StrainDesign工具（OptKnock、RobustKnock、OptCouple）进行计算机模拟菌株设计。研究所用LGG菌株为ATCC 53103。

研究结果：

共识方法生成LGG代谢的高置信度重构：研究人员建立了一套针对研究不足微生物的重构方案，在传统方案基础上引入新策略，包括合并多个独立衍生的自动生成草稿重构（步骤1.5），通过命名空间映射统一共享组分并添加各来源重构的独特组分；在步骤2、3、4中结合体外生长表型数据迭代修剪与添加反应，该数据来自化学成分明确培养基的广泛单组分缺失实验。传统重构验证与审编常依赖大规模单基因缺失数据，而本方法对环境营养物而非基因采用类似逻辑。完成LGG重构过程后得到iGR384，涵盖384个基因产物的活性。iGR384的997个反应中约72%来源于AGORA与MERLIN重构，约28%为代表基于文献与本研究中体外实验观察进行审编的新内容。重构过程涉及对AGORA与MERLIN重构中错误或证据不足内容的显著修剪，主要错误类型包括无证据地将基因注释错误分配至反应、文献证据提示LGG或其近缘种中不存在的途径、未纳入标准数据库的反应与代谢物标识符，以及仅为使先前已修剪反应产生通量而存在的非基因关联阻塞反应。对AGORA重构，该过程分别去除了57%、29%和76%的反应、代谢物和基因；对MERLIN重构，分别去除了40%、22%和88%的反应、代谢物和基因。此外，研究鉴定并使用了40项应用研究用于iGR384的重构、扩展与精炼。重构过程采用了改编自标准重构方案的修正反应证据评分系统，以应对LGG代谢机制研究匮乏的问题。iGR384中仅27%的反应具有强于简单基因功能注释的证据，仅13个反应具有来自文献的直接、反应特异性证据，凸显了开展更多LGG代谢机制研究以获得更完整知识并进而改进重构的必要性。

iGR384较自动生成草稿重构具有更高的注释与拓扑质量：研究人员使用标准化MEMOTE工具比较评估了iGR384与草稿重构的拓扑与注释质量。iGR384的总MEMOTE得分为64%，而AGORA与MERLIN重构分别得分20%与41%，表明iGR384有实质性改善。iGR384在所有MEMOTE类别中得分最高。此外，MEMOTE拓扑测试显示iGR384中所有反应方向性准确且无缺失辅因子，所有转运反应定义正确。三种重构均无热力学不可行环路，使得使用最基本模拟工具即可获得易于解释的通量状态。总体而言，iGR384较草稿模型注释更好且具有强拓扑一致性，表明其未来应用效用更大。

通过明确培养基中迭代单组分缺失表征支持LGG生长的营养物：精确的营养控制是详细表征LGG代谢能力范围以及网络重构建与验证策略所必需的。研究人员结合三种不同乳酸菌化学成分明确培养基配方开发了含52种组分的丰富明确培养基（DM52），从这三种先前培养基配方中选取每种组分的最高浓度以最大化在DM52中观察到生长的可能性。通过单组分缺失实验迭代减少DM52，得到一系列化学成分明确培养基（DM52、DM24、DM16、DM13），其复杂度与功能冗余度各不相同。LGG在所有培养基配方中均生长，但生长特征不同。导致生长速率下降的缺失表明该组分为最大生长所需。系列中更 minimal 的培养基通常放大了个体缺失的负面效应，包括始终具有有害效应的组分（如半胱氨酸）以及在DM52中最初无效应的组分（如天冬氨酸）。每种明确培养基均包含满足基本生长需求的化合物，包括能源、碳源、氮源、氨基酸、核苷酸、矿物盐与维生素/辅因子。随着培养基变得更 minimal，每种生长需求的冗余度降低。与预期相反，最丰富的培养基DM52并未支持系列中最高的生长速率，这是由于存在17种化合物在去除后生长速率出现统计学显著增加，提示其具有抑制作用。在DM52缺失实验中，另有两种组分（天冬氨酸与氨基丁酸）显示统计学显著的生长增加，被保留在DM24中。DM24中四种抑制性组分（MOPS、缬氨酸、组氨酸与MgSO4）同样被保留在DM16中。在DM16中，一种抑制性组分（缬氨酸）被保留在DM13中。这些边缘案例代表生长曲线在质量上偏离典型S形趋势或在重复间表现出高变异性的缺失。因此，研究人员在没有额外数据的情况下对去除这些组分缺乏信心。在更简单的营养背景中，补偿效应混淆结果的几率更低，可提高做出保留或去除决定的信心。在所有情况下，在后续更简单营养背景中重新测试这些缺失降低了变异性并产生更规则的生长动态，使得能够自信地去除或保留。这些负面生长效应可能表明反馈调控机制的激活。事实上，许多此类调控机制已在其他细菌物种包括其他乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）中阐明。高浓度的苯丙氨酸、甘氨酸、色氨酸与酪氨酸，连同中性至微碱性条件（如DM系列中），导致L-氨基酸转化为D-氨基酸。这些对映体已在表皮葡萄球菌、纤维二糖乳杆菌、植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌中被证明会被错误掺入肽聚糖并抑制生长。此外，在大肠杆菌K-12中，过量腺嘌呤已被证明会破坏嘌呤核苷酸平衡并随后抑制生长。在清酒乳杆菌与弯曲乳杆菌中，已证明氯化钠可诱导渗透胁迫并抑制生长。锌也被观察到可抑制嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌的生长。缬氨酸的抑制作用已在大肠杆菌K-12中得到充分表征，其既参与ilvB操纵子的调控，又可与异亮氨酰-tRNA合成酶形成抑制性复合物并降低异亮氨酸水平。所得系列明确培养基的平均最大生长速率范围为0.15/h至0.29/h，最高速率在DM24中实现。此外，这些明确培养基与先前发表的化学未定义丰富MRS肉汤（最大生长速率约0.27/h）之间的生长曲线特征总体保守。从DM52到DM24生长速率的提高可能由DM52中17种看似抑制性组分的累积消除所解释。类似地，研究人员观察到从DM16到DM13生长速率的提高，可能归因于去除了DM16中最具抑制性的组分氯化铵。值得注意的是，培养基配方还导致OD600测量值在批次间变异性的差异，DM52具有最高的批次间变异性；这可能是由于培养基的复杂性导致批次间代谢通量在不同途径中的分布不同。DM24导致最低的变异性。不同配方还具有不同的平均滞后期，DM52与DM13最短（均约1.15 h），DM16最长（约3.19 h）。DM24的平均滞后期约为2.3 h。DM52、DM24与DM13达到的最大OD600相似（OD600约1.2），但DM16较低（OD600约0.7）。研究人员得出结论，在这些配方中，DM24是最佳通用培养基，因其支持最高的最大生长速率、最低的批次间变异性、较短的滞后期、较高的最大OD600以及相对简便且低成本的制备。因此，研究人员在下游代谢物分泌实验中优先使用DM24。

iGR384能够准确模拟体外LGG生长表型：由于DM系列完全化学成分明确，这些培养基及单组分缺失表型可直接使用FBA模拟进行建模，以生物量目标函数预测生物量生产速率（作为生长速率的代理）。虽然AGORA与MERLIN的LGG模型均不支持DM系列中任何配方的生物量通量，但iGR384支持所有配方中的生物量生产。精确的模拟生物量通量与体外生长速率结果在DM24中匹配特别好，计算机模拟生物量通量为0.27/h，而平均体外生长速率为0.29/h。在DM52中，iGR384高估了体外生长速率，但这是预期之中的，因为若干DM52组分似乎在体外对生长具有负面调控效应。代谢调控未直接在iGR384中体现，且超出大多数先前GEM重构工作的范围。iGR384在DM16与DM13中一定程度上低估了体外生长速率。除比较生物量通量与观察到的生长速率外，传统GEM验证还利用基因必要性研究，研究人员以类似的单组分缺失实验替代。简言之，营养缺失根据体外数据分为"无效应"或"有害"类别，然后模拟这些单组分缺失并根据相对于相应完整培养基配方的生物量通量倍数变化进行类似分类。随后进行混淆矩阵分析，并计算准确度、召回率、精确度与特异性等模型性能指标，以评估模型重现体外表型的程度。iGR384在大多数情况下重现了所有培养基配方中的单组分缺失表型，在所有配方中至少达到50%的准确度。在DM52中，iGR384显示75%的准确度、100%的精确度与特异性以及0%的假阳性率（false positive rate，FPR）。在DM24中，iGR384以67%的准确度、60%的精确度、85%的特异性与15%的FPR运行。模型对所有培养基中有害表型的召回率较低，表明iGR384通常具有替代合成途径以补偿许多营养损失。此外，iGR384在唯一其他具有LGG单组分缺失生长数据的明确培养基中表现远好于随机水平。该配方包含44种组分，包括三种未纳入本研究DM系列配方的组分以及共享组分的不同浓度。这最后一项验证尤其值得注意，因为先前发表的数据在iGR384重构期间未被考虑，因此代表了特别严格的测试。

iGR384能够分析LGG营养需求：明确最小培养基是微生物学中理解生长基本营养需求以及作为扰动实验与代谢工程营养环境基线的重要工具。历史上，最小培养基通过一系列费力的还原性明确培养基生长实验确定，类似于本研究的迭代单组分缺失实验。GEM提供了在计算机模拟中定义最小培养基的更快速且系统的方法。研究人员使用iGR384预测了LGG的定义模拟最小培养基（simulated minimal medium，simMM）。为实现这一目标，研究人员确定了每种生物量组分与ATP维持生产所需的绝对必需营养物及任何替代营养物。这些生物量组分依赖性被用于指导最小培养基化合物的选择。葡萄糖不仅是所有生物量组分与ATP维持的依赖性，而且是胞外多糖、DNA与RNA仅有的两种依赖性之一。半胱氨酸是蛋白质、脂质与脂磷壁酸的依赖性。谷氨酸与精氨酸由于参与肽聚糖、辅因子与蛋白质合成而成为联合依赖性，同时缺乏足够的体外缺失数据以排除其中之一。CoSO4因其在辅因子合成中的必要性而被纳入。异亮氨酸因其在蛋白质合成中的必要性而被纳入。虽然天冬氨酸被预测为所有生物量组分的依赖性，但基于体外数据显示谷氨酸与天冬氨酸可互换（代表iGR384的已知失效模式），它最终被排除在最终最小培养基之外。总之，每种生物量组分依赖性均在设计的simMM中得到体现。为实现体外生长，研究人员扩展了simMM。矿物盐需求在GEM中众所周知难以建模，且未直接在生物量函数中体现，但体外缺失数据提示MgSO4与K2HPO4是LGG生长的必需盐，被保留在最小培养基配方中。此外，天冬酰胺是一种蛋白质依赖性，在DM13体外缺失时也低于20%生长速率降低阈值，被纳入模型指导的最小培养基。在对所有九种化合物进行体外单组分缺失评估后，精氨酸与异亮氨酸被确定为非必需，从而得到称为DM7的模型指导的真正最小培养基，从中去除七种化合物中的任何一种均导致LGG不生长。除识别必需营养物外，研究人员还识别了可支持生物量组分生产的营养物。研究报告了DM系列中存在的23种独特营养物，它们可在合成必需生物量组分中发挥作用，即使并非必需。总之，这些必需与支持性生物量依赖性定义了DM系列中LGG代谢生态位的营养利用能力。

吲哚-3-甲醛分泌需求的理论表征：关于LGG分泌I3A的知识来自应用性体内研究，具有后生元潜力，凸显了理解其合成途径与促进分泌条件的重要性。乳杆菌（如罗伊氏乳杆菌）及其他肠道细菌可分解代谢色氨酸，但最终合成I3A的生化过程包括负责酶仍然未知。为使用iGR384进行I3A分泌模拟，研究人员基于相关乳杆菌中的吲哚途径重构了LGG中I3A合成的推定途径。在该途径中，除两种酶外，研究人员在相关生物中鉴定到所有酶的同源物。研究人员使用iGR384预测I3A分泌作为生物量通量的函数，生成生产包络以表征使用DM配方在LGG中生产I3A的潜力。iGR384预测I3A分泌通量在DM52中可达理论最大值约3.3 mmol/gDW/h，在DM24中约2.0 mmol/gDW/h，但在两种培养基中所有生长速率下的理论最小值均为0.0 mmol/gDW/h。研究人员在LGG发酵12、24与48小时并跨越对数期与稳定期后，通过UPLC-MS在DM52中体外测量I3A生产；然而，未检测到可测量的I3A，这与模型预测的理论最小分泌通量一致。为识别可产生理论正最小I3A分泌的推定干预，研究人员进行了宽松的计算机模拟菌株设计实验。共预测104种独特菌株，允许最多三种敲除，但均未改善理论I3A生产。研究呈现了该筛选中表现最佳突变体的两个代表性示例，均未优于野生型。由于体外实验与计算机模拟均未产生可检测的I3A分泌，也未识别到可促进I3A分泌的遗传修饰，研究人员得出结论：体内I3A生产可能存在额外因素，如肠道中更丰富营养环境的组分、群体感应或其他调控效应。

LGG中乳酸分泌的生长耦合：由于乳酸菌的乳酸分泌已得到充分理解，评估该代谢输出可作为通过计算机模拟与体外生长及乳酸分泌实验之间的比较分析来检验iGR384代谢准确性的基准。研究人员在DM52与DM24中以批次培养生长LGG，配合来自相同接种物的板 reader OD600测量，每2小时采样以指导生长曲线持续时间。来自配对批次培养的匹配时间点样品被收集用于固体培养基上生长以计数菌落形成单位（colony-forming units，CFUs）并通过HPLC定量乳酸浓度。DM52与DM24之间生长速率的差异在乳酸分泌测量中得到反映，并支持乳酸分泌在厌氧条件下在LGG中呈生长耦合的假设。众所周知，乳酸菌可发酵糖类生成乳酸以通过底物水平磷酸化生成ATP。然而，在评估整个生长曲线的分泌速率时，DM52与DM24之间不同的发酵策略得以揭示。在DM52中，LGG在晚对数期与稳定期具有持续为正的乳酸分泌速率，表明乳酸发酵发生。在DM24中，LGG在滞后期发酵乳酸，随后在对数期与稳定期切换至替代途径，这由正到负的速率变化所证明。DM52的复杂性可能提供替代策略，有助于对数期生长，并在这些替代策略耗尽时回归经典发酵。总体而言，这些发现提示LGG在这些不同营养环境中具有不同的碳资源分配策略，正如在其他乳酸菌中观察到的那样。iGR384预测在DM52与DM24中最大乳酸分泌通量约23至25 mmol/gDW/h，在全部生物量通量范围内最小值为0 mmol/gDW/h。在将体外分泌速率转换为可比通量单位后，研究人员比较了中期对数期的测量乳酸分泌速率与预测分泌通量。在DM52中，中期对数期（9小时）的乳酸分泌速率约为20.0 mmol/gDW/h，接近iGR384的理论最大乳酸分泌速率23 mmol/gDW/h。对生产包络上不同代谢阶段携带通量的反应进行系统层面分析，可深入了解不同DM配方中碳分配的不同代谢选择，使模型能够提出仅靠体外方法难以评估的假设。例如，在DM52与DM24中，在观察到的生长速率下，参与脂肪酸合成的反应通量降低。然而，在较低生物量通量下，氨基酸摄取支持DM52中较高水平的乳酸分泌，而随着生物量通量增加，柠檬酸利用增加。虽然体外数据与乳酸菌中乳酸分泌呈生长耦合的先前知识一致，但LGG生产包络表明乳酸分泌在iGR384中并非完全生长耦合。这由所有生物量通量值下最小乳酸分泌速率均为零所证明。分析iGR384以识别乳酸发酵的替代ATP生成途径显示，氨基酸与核苷酸代谢途径也可在这些条件下支持生长的ATP需求。乳酸菌GEM中的发酵替代ATP生成途径并非iGR384所独有。iNF517是广泛研究的乳酸生产者乳酸乳球菌乳亚种cremoris MG1363的经人工审编GEM，同样在Flahaut等人描述的模拟条件下表现出高最大乳酸分泌，但也能够在无乳酸分泌的情况下达到最大生物量通量，使用类似的氨基酸代谢途径。这些模型中使非发酵性ATP生成成为可能的网络拓扑在这些生长条件下可能并非生理准确，或可通过用条件特异性基因表达数据对模型进行情境化或在知识允许时考虑限制通过非发酵途径通量的其他调控机制来解决。

讨论部分总结：本研究开发了用于LGG代谢跨学科研究的关键资源，包括一个经验证的基因组尺度代谢网络重构、一系列营养复杂度不同的化学成分明确培养基（包括一种最小培养基），以及来自单组分缺失实验的广泛表型生长数据。研究人员展示了如何将这些资源整合到GEM重构过程中，并应用它们机制性研究LGG中的乳酸发酵与I3A分泌。共生细菌与益生菌历史上主要在应用背景下研究，即将其引入宿主系统以观察潜在的预防或治疗益处。虽然这些研究已导致对这些微生物与宿主效应之间联系的一些理解，但对其自身内部代谢以及发挥这些效应所需营养条件的理解相对较少。关于这些分类单元个体代谢的科学文献匮乏，既凸显了需要GEM等机制性重构以进一步研究其代谢，也对传统GEM重构方法构成挑战，后者通常严重依赖已发表文献的证据。即使是研究最充分的模式细菌大肠杆菌MG1655的最新GEM iML1515，也仅约58%的反应内容具有直接文献证据。这表明需要针对此类物种的GEM重构方法与资源。许多基于约束的重构与分析（constraint-based reconstruction and analysis，COBRA）研究通过利用测序基因组的功能注释生成草稿网络来应对这一重构问题。虽然更快且需要较少广泛实验数据，但所得重构在详细代谢研究中众所周知可靠性较低。研究人员说明，扩展标准GEM重构方法以纳入利用两种工具包的共识方法并整合实验信息，可产生有用的重构。研究人员在通过自动化方法生成草稿重构后添加合并步骤，这降低了同一注释基因组不同表示之间的偏差。合并的草稿重构基于实验与文献证据进行人工审编。本研究的重构方法可应用于许多其他具备体外培养技术与草稿网络的生物体。例如，与结直肠癌相关的重要细菌具核梭杆菌具有若干自动生成的草稿重构且缺乏广泛的机制文献。将高通量明确培养基实验整合到GEM重构中，提示了一种克服研究不足物种部分资源限制以及传统重构过程中所需费劲人工步骤的解决方案。生物铸造厂与人工智能（artificial intelligence，AI）相结合已被证明能有效实现自主微生物学实验室实验，探索明确培养基空间以阐明营养需求，类似于本研究中所进行的实验。此类AI驱动的生物铸造厂若与尚待开发的下一代GEM重构算法相结合，可更快地执行整个重构过程，减少人工投入，并产生比当前最先进自动化重构方法更高质量且生物学更准确的GEM，甚至可能改善研究充分物种的GEM。通过单组分缺失实验开发明确培养基系列揭示了关于LGG营养需求的见解。研究人员发现若干氨基酸包括半胱氨酸对LGG生长必需。惰性乳杆菌也是半胱氨酸营养缺陷型，且众所周知乳酸菌通常具有氨基酸自养缺陷，这有助于其生态位形成与群落动态。研究人员还观察到LGG缺乏维生素需求。一些乳杆菌是维生素营养缺陷型，而其他如本研究中显示的LGG及其他鼠李糖乳酪杆菌属成员则需要钴用于维生素B12合成，但除此之外可合成生长所需的所有维生素。此外，研究人员评估了DM系列每种组分对生物量的贡献中的必需与支持作用。这些依赖性可被视为定义代谢生态位的营养需求。以往尝试已使用GEM基于支持生物量与分泌产物所需的交换通量来定义代谢生态位。虽然当前方法仅关注定义生态位的营养输入，但研究人员通过全面识别不仅必需而且支持的营养物并解析哪些特定生物量组分依赖于它们来扩展这一概念。结合分泌通量，这种代谢生态位分析方法可扩展到多物种群落建模，以研究明确营养环境中物种间的竞争与互利关系。除理解生态位外，GEM赋能的营养环境优化可作为控制目标微生物参与微生物群落的另一杠杆，并增强微生物GEM与现有全人类建模 scaffolding 的整合。此外，对营养需求（从必需营养物到改善特定生物量组分的化合物，如本研究使用iGR384对LGG所表征的）的全面识别可与主要分泌产物的潜力相结合，构成微生物代谢生态位的系统定义。在群落（如肠道微生物组）中建立此类代谢生态位定义，将为理解与控制群落动态及宿主相互作用提供坚实基础。理解影响LGG乳酸生产的因素可增加其作为益生菌与食品添加剂的 application 潜力。研究人员观察到乳酸发酵动态在不同培养基条件下变化。在研究人员测试的最丰富营养环境中，LGG在所有生长阶段总体分泌的乳酸少于更 minimal 的营养环境。在两种培养基条件下，LGG在稳定期分泌的乳酸也多于中期对数生长期，这对益生菌应用是有利的特性。理解这些动态适用于利用人类肠道微生物组中的群落相互作用进行治疗目的，因为乳酸可参与代谢交叉喂养相互作用，导致产生宿主有益代谢物如丁酸与I3A。乳酸还 contributes 食品产品中的风味与维生素稳定化。除评估乳酸分泌外，研究人员还评估了LGG对宿主有益I3A的分泌，得出结论LGG在DM系列中不分泌可检测水平的I3A。预测的遗传修饰未提供保证I3A分泌的解决方案。先前体内研究已检测到与LGG灌胃相关的I3A水平升高，但体外缺乏I3A检测提示可能存在促进或调控I3A分泌的复杂丰富肠道营养环境特征或缺失的群落相互作用。总之，这表明I3A的分泌并非纯粹依赖代谢资源分配，未来研究可测试肠道相关培养基条件或微生物共培养以在体外追求I3A分泌。iGR384可作为在计算机模拟中 approach 这些未来方向的有用工具，因为它包含推定的重构I3A途径。研究人员在此引入的用于机制理解与控制LGG代谢的新工具与概念框架为iGR384的若干未来应用、研究微生物组内代谢生态位以及广泛推进GEM重构方法提供了潜力。LGG具有显著治疗潜力，且已开发用于其遗传操作的工具。GEM长期以来被用于设计优化目标代谢物分泌的细菌菌株，这可应用于LGG的治疗性分泌物以影响微生物群落动态并调节肠-器官轴相互作用。