《Crop Protection》：Temperature response, fungicide sensitivity, and aggressiveness of
Colletotrichum isolates associated with cowpea anthracnose on legume hosts
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豇豆（Vigna unguiculata (L.) Walp.）是热带和亚热带地区重要的粮食豆类，在巴西既作为自给性作物，也作为商业化第二季作物在低投入农业系统中种植。然而，豇豆生产受到炭疽病的严重影响，该病由刺盘孢属（Colletotrichum）真菌引起。
豇豆（Vigna unguiculata (L.) Walp.）是热带和亚热带地区重要的粮食豆类，在巴西既作为自给性作物，也作为商业化第二季作物在低投入农业系统中种植。然而，豇豆生产受到炭疽病的严重影响，该病由刺盘孢属（Colletotrichum）真菌引起。该属包含250余个公认种，其半活体营养型生活方式加剧了病害流行与防控难度。巴西传统上认为平头刺盘孢（C. truncatum）是豇豆炭疽病的主要病原，但近期多位点与多相研究揭示C. musicola和C. plurivorum亦与巴西东北部豇豆及其他豆科植物相关。这种多样性带来了作物保护挑战，因为不同种在温度适应性、杀菌剂敏感性、致病性和侵袭力方面可能存在差异，且同种内菌株间亦可能变异。此外，这些真菌在多种豆科寄主上的发生提示了交叉侵染与接种体在轮作或邻近作物间转移的可能性。环境条件尤其是温度显著影响刺盘孢属的生长、产孢、萌发和侵染成功，温度响应的差异可能影响区域生产条件下各菌株的流行程度。化学防治仍是豆科炭疽病管理的常见手段，但杀菌剂效果可能因种和菌株而异。研究人员选取了苯醚甲环唑（difenoconazole，DMI类）和甲基硫菌灵（thiophanate-methyl，MBC类）两种内吸性杀菌剂，因这两类活性成分在巴西已登记或用于大豆炭疽病防治，且已有豆科系统中刺盘孢属群体对苯并咪唑类产生抗性、对三唑类和QoI类敏感性降低的报道。然而，关于豇豆炭疽病相关菌株对杀菌剂响应的信息仍有限。另一个知识空白涉及C. musicola和C. plurivorum的致病性与侵袭力，尤其对多种豆科寄主的侵染。本研究从皮奥伊联邦大学真菌保藏中选取4个菌株代表3个种：1个来自豇豆的C. musicola（COUFPI 167）、1个来自豇豆的C. truncatum（COUFPI 227）、2个C. plurivorum（COUFPI 650来自豇豆，COUFPI 236来自扁豆）。研究假设这些菌株在温度响应、离体杀菌剂敏感性和豆科寄主上的侵袭力方面存在差异，并可能影响病害发展与治理。研究目标为：（i）表征温度对菌丝生长、产孢和分生孢子萌发的影响；（ii）评价菌株对苯醚甲环唑和甲基硫菌灵的离体敏感性；（iii）评估菌株在豇豆、菜豆、利马豆和大豆上的致病性、侵袭力和潜育期。
**研究背景与问题**
豇豆是热带和亚热带地区重要的粮食豆类，在巴西以自给性和商业化第二季作物形式种植，其对高温和有限降水的适应性使其在气候变异和农业扩张情景下更具重要性。然而，炭疽病是豇豆生产中的重要病害，由刺盘孢属（Colletotrichum）真菌引起。该属包含250余个公认种，具有广泛的寄主范围和多样的侵染策略，其半活体营养型生活方式有利于流行成功并增加防控难度。巴西传统上认为平头刺盘孢（C. truncatum）是豇豆炭疽病的主要病原，但近期多位点与多相研究揭示了C. musicola和C. plurivorum等新种与巴西东北部豇豆及其他豆科植物相关。这种多样性带来作物保护挑战，因为不同种乃至同种不同菌株在温度适应性、杀菌剂敏感性、致病性和侵袭力方面可能存在差异，从而增加病害预测和防控的复杂性。此外，这些真菌在多种豆科寄主上的发生提示交叉侵染和接种体在轮作或邻近作物间转移的可能，尤其涉及巴西生产系统中经济重要的豇豆、菜豆（Phaseolus vulgaris）、利马豆（Phaseolus lunatus）和大豆（Glycine max）。温度等环境条件显著影响刺盘孢属的生长、产孢、萌发和侵染，温度响应差异可能影响菌株在区域生产条件下的流行程度。化学防治仍是豆科炭疽病管理的常见手段，但杀菌剂效果可能因种和菌株而异。研究人员选取苯醚甲环唑（difenoconazole）和甲基硫菌灵（thiophanate-methyl）两种内吸性杀菌剂，因其分别代表巴西农业中两类重要的单位点作用机制：脱甲基抑制剂（DMIs）和甲基苯并咪唑氨基甲酸酯类（MBCs）。这些类别与炭疽病防治相关，因巴西已有用于大豆炭疽病防治的登记杀菌剂含有这些活性成分，且豆科系统中刺盘孢属群体已报道对苯并咪唑类产生抗性、对三唑类和QoI类敏感性降低。巴西大豆生产系统中已报道C. plurivorum和C. musicola对甲基硫菌灵广泛抗性及对嘧菌酯低敏感性，分别与β-微管蛋白和细胞色素b基因突变相关。然而，豇豆炭疽病相关菌株对杀菌剂响应的信息仍有限。另一知识空白涉及C. musicola和C. plurivorum的致病性与侵袭力，尤其对多种豆科寄主的侵染。尽管C. truncatum被广泛认为是侵袭性豆科病原，但C. musicola和C. plurivorum的致病潜力表征较少。侵袭性强、热适应或耐杀菌剂的菌株可能影响寄主范围、接种体持久性和管理决策。本研究从皮奥伊联邦大学真菌保藏中选取4个菌株代表近期与豇豆及其他豆科相关的3个刺盘孢属种：1个来自豇豆的C. musicola、1个来自豇豆的C. truncatum、2个C. plurivorum（分别来自豇豆和扁豆）。研究设计为对选定菌株的比较评估而非群体水平调查。研究假设这些菌株在温度响应、离体杀菌剂敏感性和豆科寄主侵袭力方面存在差异，并可能影响病害发展和治理。
**主要技术方法**
研究人员选用4个刺盘孢属菌株：C. musicola COUFPI 167和C. truncatum COUFPI 227（均来自豇豆），以及C. plurivorum COUFPI 650（来自豇豆）和COUFPI 236（来自扁豆），均来自巴西皮奥伊联邦大学植物病理学实验室真菌保藏（COUFPI），种的身份此前经形态学和多基因系统发育分析确认。温度试验设置15、20、25、27、29、32和35 °C，评估菌丝生长速率指数（MGRI）、产孢量和分生孢子萌发，采用二次回归模型拟合，并通过方差分析和Tukey检验比较菌株在25和32 °C的表现。杀菌剂试验将苯醚甲环唑和甲基硫菌灵以0.5、1.0、1.5和2.0 μg a.i. mL?1浓度掺入PDA，于25 °C评估菌丝生长抑制和分生孢子萌发抑制。致病性和侵袭力试验在温室条件下对豇豆、菜豆、利马豆和大豆各2个品种喷雾接种分生孢子悬浮液（1×10? conidia mL?1），测定潜育期、病情严重度指数（DSI）和病情进展曲线下面积（AUDPC），并再分离验证柯赫氏法则。所有试验独立重复两次，采用完全随机设计，每处理5次重复。
**研究结果**
**温度对菌丝生长的影响**：温度显著影响各菌株的菌丝生长速率指数（MGRI），菌株×温度交互作用显著（F=7.80；p=3.588×10??）。MGRI对温度的响应可由二阶多项式回归充分描述，生长从15 °C升至约25 °C最适后随温度升高而下降。COUFPI 167（C. musicola）和两个C. plurivorum菌株COUFPI 236、COUFPI 650的最适温度相近，分别为25.2±0.49 °C、24.8±0.29 °C和24.9±0.33 °C，对应最大MGRI分别为1.59±0.13、1.78±0.09和2.01±0.12 mm day?1，三者最大生长估计值的95%置信区间重叠，无明确差异证据。相反，COUFPI 227（C. truncatum）最适温度较低（23.5±0.76 °C），最大MGRI为0.88±0.12 mm day?1，显著低于其他菌株。所有菌株在高于最适温度后生长明显下降，向35 °C时急剧降低。结果表明刺盘孢属菌株间存在温度依赖的菌丝生长差异，COUFPI 227在评估温度范围内生长能力持续较低。
**产孢与分生孢子萌发**：产孢显著受菌株×温度交互作用影响（F=24.473；p=1.607×10?12），表明菌株间热响应不同。COUFPI 167（C. musicola）产孢量最高，在35 °C时观测值最高，为72.8±3.39×10? spores mL?1，显著高于所有其他菌株。COUFPI 227（C. truncatum）在25 °C达到最大产孢，为35.0±1.41×10? spores mL?1。相反，C. plurivorum菌株产孢量低，COUFPI 236和COUFPI 650最适温度分别为32 °C和35 °C，产孢量分别为6.80±0.56和7.08±0.28×10? spores mL?1，两者无显著差异。分生孢子萌发亦显著受菌株×温度交互作用影响（F=7.699；p=1.091×10??）。COUFPI 227萌发率最高，最适27 °C，为92.0±1.41%，其次为COUFPI 236，在35 °C达84.0±1.41%。COUFPI 650最适25 °C，萌发率69.0±1.45%，而COUFPI 167最大萌发率最低，估计为32 °C时55.5±3.54%。Tukey检验显示所有菌株最大萌发率间差异显著。
**离体对杀菌剂的响应**：苯醚甲环唑持续降低所有菌株的菌丝生长，抑制率一般随浓度增加而升高。COUFPI 650、COUFPI 167和COUFPI 236抑制率最高，COUFPI 227抑制率相对较低。相反，甲基硫菌灵对大多数菌株菌丝生长的活性有限，各浓度下抑制率低或变异大，例外为COUFPI 227，其甲基硫菌灵抑制率相对高于其他菌株。杀菌剂对分生孢子萌发的效果因菌株、杀菌剂、浓度和孵育时间而异。COUFPI 650的苯醚甲环唑在两个孵育时间均持续高度抑制分生孢子萌发，而甲基硫菌灵无明显浓度依赖抑制模式。COUFPI 227的甲基硫菌灵效果随浓度增加而增强，尤其12 h后。COUFPI 167和COUFPI 236响应更多变，两种杀菌剂各浓度和孵育时间下效果低或不一致。总体而言，苯醚甲环唑抑制菌丝生长更有效，而对分生孢子萌发的效果更依赖菌株。
**致病性与侵袭力**：所有菌株在评估寄主上均引起炭疽病症状，确认其致病性。潜育期因菌株–品种组合而异，症状约在接种后5至11 d出现。COUFPI 227（C. truncatum）和COUFPI 650（C. plurivorum）在各品种上潜育期相对短且稳定，而COUFPI 167（C. musicola）和COUFPI 236（C. plurivorum）在寄主基因型间变异较大。病情严重度从接种后15 d至30 d增加。30 d时，BRS Pérola上病情指数最高，尤其COUFPI 227、COUFPI 167和COUFPI 236，严重度分别达100%、96%和88%。Colosso和BRS FP403在多个菌株上亦表现高严重度，而Branquinha持续表现最低严重度，30 d时为28%至52%。侵袭力以病情进展曲线下面积（AUDPC）评估，显著受菌株、品种及菌株×品种交互作用影响（p<0.001），表明寄主–病原组合间响应不同。AUDPC值证实BRS Pérola、Colosso和BRS FP403上病害发展更重，Branquinha病害进展最低。总体表明菌株具有广泛致病性，侵袭力因真菌菌株和寄主品种而显著变异。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究提供了与豇豆炭疽病相关的刺盘孢属菌株在温度响应、离体杀菌剂敏感性、潜育期和侵袭力方面的比较信息，结果揭示菌株水平变异，包括两个C. plurivorum菌株间的差异，并强调豆科生产系统中该病理系统的复杂性。尽管评估菌株数量有限，菌株间的对比响应表明在设计豇豆炭疽病管理策略时应综合考虑热适应、杀菌剂敏感性、寄主范围和流行发展。所有菌株在较宽温度范围内保持生物学活性，但菌丝生长、产孢和分生孢子萌发的幅度因菌株和发育阶段而异；C. musicola菌株在上限温度下产孢特别高，而菌丝生长和萌发响应更依赖性状。这些结果与Salotti等（2022）对刺盘孢属的广泛分析一致，即该属种在较宽温度范围内保持活性，但最适温度和热响应模式因分支和种而异；本研究变异不仅见于种间，也见于两个C. plurivorum菌株间，强化了菌株水平差异的重要性。C. musicola菌株在高温下活性较高可能反映其维持细胞和代谢功能的生理机制，如膜稳定性、蛋白质结构和酶活性维持及胁迫响应通路调节，这些机制与真菌热胁迫响应的一般认识一致（Xiao et al. 2022），但本研究未直接评估，需未来用生理、生化或转录组方法研究。C. musicola的潜在耐热性在热带豇豆种植区可能具有流行学意义，但因仅评估1个菌株，应解释为菌株水平热适应的证据而非种级特征。杀菌剂方面，苯醚甲环唑在测试条件下比甲基硫菌灵更持续地降低菌丝生长和分生孢子萌发，但两者在评估浓度下均未完全抑制所有菌株，表明离体敏感性存在菌株依赖变异，甲基硫菌灵对本研究菌株可能仅提供有限抑制活性。豆科刺盘孢属群体中苯并咪唑类抗性和其他杀菌剂组敏感性降低的既往报道（Brent and Hollomon 2007; Linhares de Castro et al. 2024; Lucas et al. 2015; Price et al. 2015）强化了持续监测的必要性。实践中，甲基硫菌灵较低抑制支持谨慎重复使用苯并咪唑类杀菌剂，杀菌剂方案应避免连续施用同一作用机制产品，并按标签推荐和当地法规轮换或混用不同FRAC组杀菌剂以减少抗性选择压力。由于试验为离体且浓度范围有限，结果不应解释为田间药效或田间抗性的直接证据，而表明菌株间差异抑制响应，强调将杀菌剂敏感性监测纳入炭疽病管理规划的重要性。菌株间未观察到苯醚甲环唑和甲基硫菌灵的一致交叉敏感性模式，但因仅评估对两种杀菌剂的表型响应且未评估抗性分子标记，未正式推断交叉抗性。致病性方面，所有菌株对豇豆、菜豆、利马豆和大豆均致病，表明评估菌株能侵染多种豆科寄主，但病情严重度因菌株–寄主组合而异，揭示侵袭力和寄主响应差异。菜豆和大豆为本研究中最感病寄主之一，而利马豆品种Branquinha病情严重度相对较低，该较低感病性应仅针对Branquinha品种解释，不应推广至利马豆整个种。本研究的侵袭力模式与豆科相关刺盘孢属种已知的广泛寄主范围大体一致。C. truncatum是豆科包括大豆、豇豆和利马豆的重要炭疽病病原，而C. plurivorum和C. musicola亦与巴西及其他地区大豆和其他豆科寄主相关。因此，在大豆和菜豆上观察到的致病性与这些种侵染多种豆科的能力一致。然而，某些菌株在非原始寄主上引起高严重度表明寄主来源本身可能无法预测侵袭力，这对轮作有实际意义，因连续或邻近种植的感病豆科作物可能促进生产系统间接种体转移。多种豆科上的致病性对接种体维持和病害转移有直接意义，高感病豆科寄主尤其大豆和菜豆可能促进侵袭性刺盘孢属菌株在豇豆田连作或邻近种植时的存活和增殖，因此有炭疽病史地区应尽可能避免在高感病豆科寄主后序种植豇豆，豇豆田靠近有活动性炭疽病症状的大豆或菜豆田可能增加交叉侵染和局部接种体积累风险。作物规划应考虑感病豆科间空间隔离、与非寄主轮作、病残体管理和使用较不感病品种。潜育期数据对病害预测和施药时机亦有实际意义，潜育期较短的菌株–寄主组合可导致症状更快出现和流行发展更快，缩短预防干预窗口；在有利环境条件下，较短潜育期可能提示杀菌剂施用或其他保护措施需更早进行。C. truncatum和C. musicola菌株在多个寄主背景上相对较高的侵袭力提示这些菌株可能是豆科生产区炭疽病病理系统的重要组分；两个C. plurivorum菌株间的变异则强化了评估致病潜力和流行风险时考虑种内多样性的重要性。由于仅纳入4个菌株，这些发现应解释为可能流行学模式的提示而非种侵袭力的确定性排序。综上，具有不同温度响应、可变侵袭力、不同潜育期和对比离体杀菌剂敏感性的菌株共存可能使豇豆生产系统炭疽病管理复杂化。
结论部分译文：本研究评估的刺盘孢属菌株在温度响应、离体杀菌剂敏感性和豆科寄主侵袭力方面存在差异。C. musicola菌株在上限测试温度下产孢特别高，而菌丝生长和分生孢子萌发响应在菌株间更依赖性状。苯醚甲环唑的离体抑制活性大于甲基硫菌灵，但两者在测试条件下均未完全抑制菌株。所有菌株对豇豆、菜豆、利马豆和大豆均致病，表明其他豆科寄主在接种体转移中的作用。综上，这些发现强调在制定豆科生产系统中豇豆炭疽病综合治理策略时需考虑菌株水平变异、寄主范围和杀菌剂响应。
