基于UHPLC-MS/MS与特征分子网络联用的葎草乙醇与水提物植物化学比较分析

《Cogent Food & Agriculture》：Comparative phytochemical analysis of Humulus scandens (Lour.) Merr. ethanol and aqueous extracts using UHPLC-MS/mS combined with feature-based molecular networking

　　

葎草（Humulus scandens (Lour.) Merr.，简称HS）是一种隶属于大麻科（Cannabaceae）的药用植物，广泛分布于东亚地区。尽管其传统上被用于健康相关目的，但其植物化学特征尚未被完全阐明，尤其是不同提取溶剂如何影响生物活性化合物这一问题仍不清楚。水和乙醇是草药医学和食品加工中最常用的两种溶剂。水提反映了传统煎煮实践，而乙醇提取因其能够提取更广泛的化合物而被广泛用于现代研究。因此，比较这两种溶剂对于将传统用途与现代功能性食品开发联系起来具有重要意义。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）结合基于特征的分子网络（feature-based molecular networking，FBMN）对葎草的乙醇提取物和水提物进行比较分析。研究人员在乙醇提取物中共注释了164种化合物，在水提物中注释了136种化合物，其中51种为两者共有。统计分析显示，N-对香豆酰酪胺（N-p-coumaroyltyramine）、阿魏酰酪胺（feruloyltyramine）和精氨酸（arginine）在乙醇提取物中显著富集。尽管两种提取方法呈现出高度重叠的植物化学特征，但乙醇提取提供了更广泛的代谢物覆盖范围，并优先富集了上述三种判别性代谢物。这些发现为选择合适的提取方法提供了依据，并支持葎草来源功能性食品和营养保健品的开发。

论文解读

一、研究背景与科学问题

葎草（Humulus scandens (Lour.) Merr.，HS）是一种隶属于大麻科（Cannabaceae）的雌雄异株多年生攀援藤本植物，广泛分布于中国、韩国和日本的湿地、丘陵、林地及山谷地区。在传统医学中，葎草长期被用于治疗充血、血尿、淋证、水样腹泻和疮疡等病症，并具有利尿和促进肾功能的作用，同时也被用作蛇蝎咬伤的民间解毒药。当代药理学研究表明，葎草具有多种生物活性，包括潜在的抗癌、保肝、抗炎、抗氧化、镇痛、止泻和脂质代谢调节作用。此外，中药系统药理学数据库（TCMSP）数据提示其在代谢性疾病、睡眠障碍、眼科疾病、肌肉疾病和发育障碍等方面具有潜在应用价值。

然而，葎草的整体植物化学组成尚未被充分表征。提取溶剂的选择是影响植物材料中植物化学物组成的关键因素。在食品科学领域，乙醇和水因其安全性、可获得性以及与食品级加工的兼容性而成为最常用的溶剂。水提法广泛应用于传统煎煮体系和功能性食品制备，因其安全性、无毒性和对亲水性化合物的兼容性而受到青睐；相比之下，乙醇提取对中等极性和亲脂性植物化学物具有更强的回收能力。因此，乙醇和水提方法可能产生显著不同的植物化学特征，进而影响葎草产品的营养价值、生物活性、感官特性及潜在功能性食品应用。对这两种提取方法进行比较评估，对于未来食品和营养保健品开发中选择合适的制备策略具有重要意义。

超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）因其高灵敏度、高分辨率和通量已成为天然产物代谢物综合表征最强大的分析技术之一。基于特征的分子网络（FBMN）集成于全球天然产物社会分子网络（GNPS）平台，通过谱库匹配和in silico预测提供光谱聚类、结构注释和结构相关代谢物可视化的先进计算工作流。与传统的靶向分析相比，该策略能够实现对草药植物化学特征的系统性和大规模表征。本研究旨在利用UHPLC-MS/MS结合FBMN对葎草乙醇和水提物的植物化学特征进行表征和比较，特别关注识别与不同提取方法相关的差异生物活性化合物。

二、关键技术方法

研究人员采用以下主要技术方法开展研究：葎草新鲜地上部分于2024年9月采自中国辽宁省锦州市一栽培基地（41.09623°N，121.11908°E），经分类学家鉴定后存档于机构标本馆。乙醇提取采用75%（v/v）乙醇，料液比1:20（w/v），50°C提取60分钟；水提采用蒸馏水加热至95°C，相同料液比，提取5小时。化学分析采用Vanquish超高效液相色谱平台（Thermo Fisher Scientific）配备Kinetex C18色谱柱（2.1×50 mm，2.6 μm；Phenomenex），检测在Orbitrap Exploris 120质谱仪上进行，电喷雾电离（ESI）正负离子模式同时采集，数据依赖性扫描模式由Xcalibur软件控制。原始数据经ProteoWizard转换为mzXML格式，基于XCMS框架的R语言流程进行峰检测、保留时间校正和特征对齐。FBMN在MZmine中处理数据后上传至GNPS平台，应用DEREPLICATOR、MS2LDA、NAP和MOLNETENHANCER工作流，网络在Cytoscape中可视化。化学计量学分析使用MetaboAnalyst 6.0，包括单变量分析计算调整后p值和log₂倍数变化（FC），以及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）确定变量投影重要性（VIP）得分。

三、研究结果

色谱特征分析：正离子模式下，乙醇和水提物的色谱图整体模式高度相似，均以保留时间初期m/z 381.0790/381.0787的强离子信号为特征，随后在中后期保留阶段形成宽泛且持续升高的信号区域，基线逐渐升高形成未分辨的信号包络而非清晰色谱峰，表明存在大量共洗脱代谢物或基质来源化合物。负离子模式下，两种提取方法表现出更明显的差异：乙醇提取物呈现显著更高的色谱复杂性，具有多个分离良好且尖锐的峰；水提物色谱组织相对不那么拥挤，重叠信号较少，峰边界更清晰，表明负离子化成分的整体化学复杂性较低且分辨率更好。

分子网络分析：乙醇提取物在正离子模式下产生919个节点（104个注释），负离子模式下产生1222个节点（104个注释）；水提物在正离子模式下产生1013个节点（100个注释），负离子模式下产生1283个节点（72个注释）。仅选择包含超过50个节点的子网络进行详细分析。乙醇提取物正离子模式注释了两个子网络，分别主要由磷脂酰乙醇胺、甘油酯、氧化脂质和多不饱和脂肪酸衍生脂质缀合物组成，以及以含胆碱甘油磷脂（特别是磷脂酰胆碱）为主。负离子模式中，一个子网络富集多种甘油磷脂类（磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和磷脂酸），另一个以糖苷和碳水化合物缀合物为特征。水提物正离子模式中单个大子网络主要由氧化脂质、脂肪酸氧化产物和倍半萜内酯组成；负离子模式中两个子网络分别主要由苯丙素类和黄酮类衍生代谢物及其糖苷组成，以及以碳水化合物和糖醇为主。FBMN揭示了溶剂依赖的分子家族分布差异：乙醇提取优先富集脂质相关代谢物，水提则偏向多酚、黄酮、糖苷和碳水化合物相关代谢物。

化学计量学分析：跨正负离子模式汇总，乙醇提取物注释了164种非冗余生物活性化合物，水提物注释了136种，其中113种仅存在于乙醇提取物，85种仅存在于水提物，51种为两者共有。主成分分析（PCA）显示两组间清晰分离，置换多元方差分析（PERMANOVA）确认提取方法间整体植物化学组成差异显著（p = 0.026）。OPLS-DA显示样本按提取方法明显聚类，模型拟合优度（R²Y = 0.901）和预测能力（Q² = 0.842）良好，1000次置换检验确认模型稳健性（R²Y的p = 0.041，Q²的p = 0.016）。采用调整后p值 < 0.05、|log₂ FC| > 1和VIP > 3.0的阈值，鉴定出三种显著差异化合物：N-对香豆酰酪胺（调整后p值 < 0.01；|log₂ FC| = 11.55；VIP = 4.72）、阿魏酰酪胺（调整后p值 < 0.01；|log₂ FC| = 8.88；VIP = 3.80）和精氨酸（调整后p值 < 0.01；|log₂ FC| = 5.03；VIP = 3.28），三者均在乙醇提取物中显著富集。

差异代谢物生物活性：阿魏酰酪胺具有乙酰胆碱酯酶抑制作用，并表现出抗炎和抗氧化活性，包括抑制脂多糖诱导的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）表达，机制涉及AP-1和JNK信号通路抑制。N-对香豆酰酪胺具有抗炎、抗氧化、抗菌作用，并通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶表现出抗糖尿病潜力，同时也是剂量依赖性乙酰胆碱酯酶抑制剂，提示可能的神经保护特性。精氨酸作为半必需氨基酸，是一氧化氮生物合成的主要前体，在血管功能、免疫调节、伤口愈合和蛋白质合成中发挥重要作用。

四、讨论与结论

研究讨论指出，乙醇和水提方法不仅在溶剂组成上存在差异，提取温度和持续时间也不同，反映了先前研究中常用的传统提取程序，因此观察到的植物化学差异应被解释为溶剂选择性和提取条件的综合效应而非仅溶剂组成单独作用。尽管存在这一局限性，研究发现乙醇和水提回收了大部分重叠的代谢物，但乙醇提取产生了更多注释成分，并优先富集了N-对香豆酰酪胺、阿魏酰酪胺和精氨酸三种提取依赖性植物化学标记物。根据先前研究，这些化合物与抗氧化、抗炎、抗糖尿病、神经保护和心血管代谢活性相关，但本研究未评估这些生物效应。研究结论指出，乙醇和水提是互补而非竞争的方法：水提仍适用于传统食品和草药制剂，而乙醇提取在需要富集特定生物活性成分以开发和标准化葎草来源功能性食品和营养保健品时可能具有优势。这些发现为根据预期植物化学组成和应用目的选择合适的提取策略提供了科学依据，也为未来质量控制、提取标准化和生物活性导向研究提供了植物化学参考数据。