小分子调控前体信使RNA剪接：从剪接位点选择机制到治疗应用

《Current Opinion in Structural Biology》：Modulation of pre-mRNA splicing by small molecules

　　

前体信使RNA的选择性剪接是基因调控的重要机制，在多种病理过程中经常发生改变。最新进展表明，调节剪接位点选择可为未满足的医疗需求提供新的治疗选择。本文综述了有助于解释剪接位点选择基本原理及其被小分子调控的结构和功能数据，包括分支点识别抑制剂的定向效应，以及用于修复对5'剪接位点识别至关重要的不完美碱基配对相互作用的嵌入化合物的效应。剪接体具有显著的复杂性和多功能性，尽管剪接位点序列具有多样性，仍能以单核苷酸精度切除内含子，这为选择性调节剪接位点选择以应用于基因调控和治疗提供了独特机遇。

论文解读：小分子调控前体信使RNA剪接的结构基础与治疗前景

一、研究背景与科学问题

前体信使RNA（pre-mRNA）剪接是将信使RNA前体中的内含子去除、外显子连接的过程，该过程由剪接体（spliceosome）这一由超过150种蛋白质和五种小核RNA（U1、U2、U4、U5和U6小核RNA）组成的复杂分子机器执行。约90%至95%的人类多外显子基因经历选择性剪接（alternative splicing，AS），这是多细胞生物细胞分化、组织稳态和蛋白质组多样化的核心机制之一。然而，这种调控灵活性也使剪接机器易于受到干扰。顺式调控序列或反式剪接因子的突变可导致多种人类疾病，包括神经退行性疾病、肌营养不良和癌症。

剪接作为治疗靶点的可行性已通过诺西那生（nusinersen，一种剪接转换反义寡核苷酸）和利司扑兰（risdiplam，一种小分子嵌入化合物）治疗脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）的临床批准得到证实。然而，小分子调控剪接位点选择的结构基础和分子机制仍存在诸多未解之谜，特别是不同化学类型化合物如何实现靶标选择性、如何在不抑制整体剪接的前提下特异性调控特定剪接事件等问题亟待深入解析。

二、研究内容与主要结论

该综述系统梳理了剪接体组装早期阶段作为药物干预关键窗口的结构证据，重点聚焦两类机制明确的小分子调控策略：靶向分支点（branch point，BP）识别的SF3b复合物抑制剂，以及稳定U1小核核糖核蛋白（U1 snRNP）与5'剪接位点（5' splice site，5' ss）相互作用的"凸起修复"型调节剂。

三、关键技术方法

研究人员综合运用了冷冻电镜（cryo-EM）结构解析技术，获取了人源17S U2小核核糖核蛋白颗粒（snRNP）开放构象和pre-B剪接体闭合构象的高分辨率结构；采用核磁共振（NMR）波谱学解析了利司扑兰与U1小核RNA（snRNA）:5'剪接位点RNA双螺旋的相互作用模式；结合高通量化合物筛选（约140万化合物库）鉴定先导化合物；利用荧光偏振（fluorescence polarization）结合纯化天然和重组U1小核核糖核蛋白颗粒进行体外结合实验；运用单分子研究技术分析药物与U1 snRNP/U1C/5'剪接位点复合物的组装动力学；通过转录组学分析（transcriptome-wide analysis）评估SF3B1^K700E突变对分支点相互作用和3'剪接位点选择的影响；并整合临床前脊髓性肌萎缩症小鼠模型和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）患者来源神经元筛选数据验证化合物的体内效应。

四、研究结果

靶向分支点：SF3b抑制剂

SF3B1蛋白的HEAT结构域重复序列与PHF5A亚基形成的口袋特异识别从U2小核RNA:前体信使RNA双螺旋中凸出的分支点腺苷（BP A）。结构研究揭示SF3B1存在"开放"和"闭合"两种构象状态，闭合构象作为分子钳夹持分支点腺苷并将其递送至剪接体催化中心。目前三类结构相关的天然产物家族——普拉二烯内酯类（pladienolides）、赫博西丁类（herboxidienes）和剪接抑制素类（spliceostatins）——通过双重抑制模式发挥作用：直接占据分支点腺苷结合口袋，同时将SF3B1锁定在开放构象，阻止HEAT重复序列闭合。值得注意的是，剪接抑制素家族化合物通过其环氧基团与PHF5A亚基锌指结构域第26位半胱氨酸形成不可逆共价键，而普拉二烯内酯和赫博西丁则呈可逆结合。E7107作为首个进入临床试验的SF3b抑制剂，以及H3B-8800在I期试验中的表现，虽因视力和疗效问题受阻，但非细胞毒性浓度下这些化合物可特异性改变选择性剪接事件而非全面抑制剪接，且H3B-8800与BCL2抑制剂维奈克拉（venetoclax）在慢性淋巴细胞白血病模型中显示协同杀伤SF3B1突变细胞的作用。此外，新发现的合成化合物WX-02-23共价结合SF3B1第1111位半胱氨酸，通过稳定SF3b复合物与DDX42解旋酶的瞬时相互作用而非锁定开放构象发挥功能，揭示了SF3B1 HEAT重复支架上除分支点结合口袋外的其他药物靶向区域。

U1小核RNA:5'剪接位点"凸起修复"调节剂

第二类剪接调节药物通过稳定U1小核RNA与非经典5'剪接位点之间的碱基配对来增强剪接。脊髓性肌萎缩症相关SMN2基因外显子7末端存在非经典的GA二核苷酸，导致U1小核RNA:5'剪接位点双螺旋中形成未配对的腺苷凸起（A_?1），削弱U1小核核糖核蛋白颗粒的结合稳定性。利司扑兰（risdiplam）和布兰纳普兰（branaplam）作为两种化学结构不同的先导化合物，通过嵌入RNA双螺旋并与凸起腺苷形成氢键来"修复"这一凸起结构。利司扑兰从香豆素先导化合物经多轮优化最终形成吡啶并嘧啶酮骨架，于2020年8月获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于脊髓性肌萎缩症治疗。布兰纳普兰则通过约140万化合物的高通量筛选获得哒嗪-哌啶骨架。关键研究发现，布兰纳普兰不结合游离RNA双螺旋，其结合需要U1C蛋白参与U1小核核糖核蛋白颗粒与5'剪接位点结合后的有序组装过程，表明这些化合物识别的是复合的RNA-蛋白质结构环境而非单纯RNA序列。单分子和生化研究表明，药物选择性取决于局部序列（N_?3G_?2A_?1或A_?3G_?2A_?1）以及凸起形成的结构要求，且U1稳定化后需与后续U6小核RNA交接步骤的序列兼容性共同决定整体位点选择性，形成"两级筛选"机制。布兰纳普兰还被发现可促进亨廷顿病相关HTT基因隐蔽外显子50a的包含，通过无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated decay，NMD）降低突变亨廷顿蛋白水平，但临床试验因周围神经病变安全性问题而暂停。后续开发的沃托普兰（votoplam）和SKY-0515已分别进入III期和II/III期临床试验，其中SKY-0515还通过促进PMS1基因隐蔽外显子5b包含来降低促进CAG重复体细胞扩增的PMS1蛋白表达，实现双重治疗机制。

其他特征尚不明确的调节剂

多种化合物作为化学探针用于解析剪接过程的不同阶段：CP028抑制A复合物向B复合物的转变；BN82685阻断第二步转酯反应；马德拉辛（madrasin）和异银杏双黄酮（isoginkgetin）将组装阻滞在A复合物阶段，且后者衍生物IP2可重塑主要组织相容性复合体I类（MHC-I）免疫肽组以增强抗肿瘤免疫应答；OTS964作为CDK11激酶的高选择性ATP竞争性抑制剂，通过抑制SF3B1磷酸化将剪接体阻滞在BRR2介导的激活之后但成熟B^act复合物形成之前的状态。

五、讨论与结论

该综述强调，剪接体组装早期复合物E和A是药物调节选择性剪接位点选择的关键检查点窗口。SF3b抑制剂和5'剪接位点凸起修复剂代表了两种互补的治疗策略：前者通过拮抗U2小核核糖核蛋白颗粒在分支点的组装来抑制特定剪接事件，后者通过增强U1小核核糖核蛋白颗粒对弱5'剪接位点的识别来促进外显子包含。尽管面临毒性挑战和选择性不足等问题，这些化合物作为研究剪接体功能的重要工具，以及在非细胞毒性剂量下与其它疗法联用的策略，展现了广阔的转化应用前景。结构研究揭示的SF3B1构象转变、PHF5A锌指反应性硫醇盐机制以及U1小核RNA:5'剪接位点凸起修复的分子细节，为下一代更具选择性和安全性的剪接调节药物设计奠定了理论基础。