稳定性指示型RP-HPLC方法的开发与验证：同时测定直接压片片剂中达芦那韦乙醇合物与利托那韦及其在含量测定、强制降解、溶出度与绿色度评价中的应用

《Current Pharmaceutical Analysis》：Development and validation of a stability-indicating RP-HPLC method for simultaneous estimation of darunavir ethanolate and ritonavir in tablet dosage form

　　

背景：本研究旨在开发并验证一种简单、快速且具稳定性指示能力的反相高效液相色谱（reverse-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）方法，用于同时测定原料药及直接压片片剂中的达芦那韦乙醇合物（darunavir ethanolate，DE）与利托那韦（ritonavir，RTV），并应用于含量测定和溶出度研究。方法：采用C₁₈柱，以乙腈与0.1%正磷酸（orthophosphoric acid，OPA）（55:45，v/v）为流动相，在等度条件下进行色谱分离。流速为1.2 mL/min，检测波长为240 nm。该方法依据ICH Q2(R2)指南进行验证。在酸性、碱性、氧化和热条件下开展强制降解研究。采用无氯化溶剂分析程序指数（Chlorinated Solvents-Free Analytical Procedure Index，CaFRI）、改良绿色分析程序指数（Modified Green Analytical Procedure Index，MoGAPI）及环境、实用性与性能指数（Environmental, Practicality, and Performance Index，EPPI）评价方法绿色度。结果：DE和RTV分别在4.22和7.68 min洗脱，总运行时间为10 min，峰分离良好且峰形对称。该方法在线性、准确度、精密度、专属性及灵敏度方面表现满意，精密度结果在可接受范围内。强制降解研究表明，待测物与降解相关峰实现充分分离。溶出度研究提示，pH对RTV释放的影响较对DE释放更明显。CaFRI、MoGAPI和EPPI绿色度评价显示总体分析特征良好。与已报道方法相比，所建方法分析时间更短、流动相消耗更少，并更广泛地应用于含量测定、强制降解及溶出度研究。结论：所建方法适用于已开发片剂中DE和RTV的常规质量控制分析及溶出度评价。然而，乙腈的使用仍是环境方面的局限，且未按照ICH Q1B开展受控光稳定性试验。将该方法应用于其他处方和复杂药物基质前仍需进一步验证。

研究背景与立题依据：联合抗逆转录病毒治疗是HIV感染管理的重要策略；DE为HIV-1蛋白酶抑制剂，RTV常通过强效抑制细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）作为药动学增效剂。两药水溶性差，分别属生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system，BCS）II类和IV类，溶出是口服生物利用度的关键限制；RTV溶解度呈明显pH依赖性，在酸性条件下升高而肠道pH下显著降低，可能导致固体制剂释放和吸收变异。直接压片虽可规模化，但不能固有解决溶解度问题。已报道的同时测定方法多采用梯度洗脱、分析时间较长，或主要面向常规含量/杂质谱，尚缺乏适用于新型直接压片DE-RTV片剂含量、强制降解和溶出评价的简单快速稳定性指示等度RP-HPLC法。因此，研究人员开发并验证该方法，并将其用于自制片剂、强制降解、溶出度、绿色度及与报道方法的比较。其意义在于为制剂开发和质量控制提供分析时间较短、流动相消耗较低且应用范围较广的定量工具。

关键技术方法：建立C₁₈柱、乙腈-0.1% OPA（55:45，v/v）、1.2 mL/min、240 nm的等度RP-HPLC法，并按ICH Q2(R2)验证系统适用性、专属性、线性与范围、准确度、精密度、检测限（limit of detection，LOD）/定量限（limit of quantitation，LOQ）、稳健性和耐用性；开展酸、碱、氧化及热强制降解；制备DE 100 mg/RTV 50 mg直接压片（DE、RTV原料药由MLL，印度海得拉巴赠样，批号2200000071、25518046）；进行含量测定、美国药典（USP）II法（pH 1.2和6.8）溶出及Korsmeyer-Peppas拟合；以CaFRI、MoGAPI、EPPI评价绿色度并与报道方法比较。

研究结果：
3.1 方法优化：通过考察有机溶剂、OPA浓度、流动相比例和流速，确定甲醇条件下DE无可检出峰而ACN可实现分离，最终采用C₁₈柱、ACN:0.1% OPA（55:45，v/v）、1.2 mL/min、240 nm，总运行时间10 min，DE和RTV保留时间分别为4.22和7.68 min。
3.2 系统适用性：连续6次进样显示DE/RTV峰面积%RS为0.17%/0.15%，理论板数为7144/11505，拖尾因子为1.09/1.01，容量因子为2.03/2.70，系统适用性可接受。
3.3 专属性与选择性：通过空白、安慰剂、片剂和溶出样品色谱图确认，在DE和RTV保留时间处无干扰峰。
3.4 强制降解研究：酸、碱、氧化和热条件下DE降解10.20%～31.41%，RTV降解6.10%～63.30%；RTV在酸、碱下更易降解，二者在氧化下约降解30%，热降解较低，且主峰与降解相关峰分离良好。
3.5 线性与范围：在10～60 μg/mL和2～20 μg/mL范围内，DE、RTV峰面积与浓度线性良好，R²均为0.999。
3.6 准确度：标准加入法在80%、100%、120%水平显示，10～60 μg/mL范围DE回收率98.83%～100.76%、RTV 98.96%～100.20%；2～20 μg/mL范围DE 101.50%～101.99%、RTV 99.51%～100.32%，%RSD多低于1%。
3.7 精密度：日内和日间精密度显示，30 μg/mL时DE的%RSD为0.19%～0.87%、RTV为0.08%～0.72%；5 μg/mL时DE为0.20%～0.55%、RTV为0.19%～0.30%。
3.8 检测限与定量限：由响应标准差和校准曲线斜率计算，10～60 μg/mL范围内DE的LOD/LOQ为2.21/6.69 μg/mL，RTV为1.05/3.18 μg/mL。
3.9 稳健性：通过改变流速（1.1、1.3 mL/min）、波长（238、242 nm）和流动相比例（53:47、57:43，v/v），峰面积%RSD≤2%，但DE、RTV保留时间随流速和流动相比例变化。
3.10 耐用性：不同日期分析显示DE的%RSD为0.51%～0.60%、RTV为0.48%～0.71%，符合常规内部%RSD≤2%标准。
3.11 自制片剂含量测定：将方法用于DE-RTV直接压片，DE和RTV含量分别为标示量的98.07%和97.87%，处于类似制剂推荐含量限度内。
3.12 溶出研究：USP II法显示pH 1.2下5 min DE、RTV累积释放分别为34.74±0.21%和46.31±0.42%，60 min为76.67±0.36%和80.31±1.41%；pH 6.8下60 min DE达95.31±0.1%，RTV仅17.37±0.6%；Korsmeyer-Peppas拟合得DE在pH 1.2、6.8的释放指数n为0.62、1.05，RTV为≤0.45、0.24。
4 与已报道方法的比较及绿色度评价：与梯度法（36 min、约28.8 mL/次）和另一等度法（15 min、约13.5 mL/次）相比，本方法10 min、约12.0 mL/次，流动相消耗分别降低约58.3%和11.1%，并覆盖含量、强制降解和溶出研究；CaFRI、MoGAPI和EPPI评价总体有利，EPPI总分85.90，高于对比方法的64.70和70.50，但乙腈使用仍是环境局限。

讨论部分总结：优化条件实现10 min内分离；系统适用性、线性、准确度、精密度、稳健性和耐用性支持定量分析。强制降解显示两药稳定性差异，RTV在酸、碱下更易降解，氧化下二者约降解30%，热降解有限，主峰与降解峰分离支持稳定性指示能力。含量测定显示方法适用于自制片；溶出显示pH对RTV释放影响更明显，DE在pH 6.8释放较高而RTV显著较低；Korsmeyer-Peppas释放指数需结合拟合范围和模型假设解释，低RTV释放提示当前直接压片处方需进一步研究，可探索无定形固体分散体或微环境pH调节。与报道方法相比，本方法分析时间更短、流动相消耗更低、操作更简单且应用更广；绿色度评分较好但乙腈仍是限制；因设施不可用未按ICH Q1B开展受控光稳定性研究。

研究结论翻译：已开发并验证一种简单、快速且具稳定性指示能力的RP-HPLC方法，用于同时测定直接压片片剂中DE和RTV。优化条件为C₁₈柱、乙腈与0.1% OPA（55:45，v/v）等度洗脱、1.2 mL/min、240 nm检测，DE和RTV在10 min运行时间内实现满意分离。方法在专属性、线性与范围、准确度、精密度、稳健性、LOD和LOQ方面表现满意，支持其用于定量分析。强制降解研究显示方法具稳定性指示能力，药物峰与降解相关峰充分分离。重要的是，方法成功用于所开发DE-RTV片剂的含量测定和溶出评价，表明其在制剂开发和质量控制中的实用性。CaFRI、MoGAPI和EPPI评价显示总体绿色分析特征优良。然而，与乙醇等更绿色溶剂相比，乙腈作为有机改性剂仍是局限，尽管短时等度运行有助于降低溶剂消耗和废物产生。未来研究包括按ICH Q1B开展受控光稳定性研究，以获得更多强制降解信息。此外，当前方法仅应用于所开发DE-RTV片剂，用于其他处方和更复杂药物基质时可能需进一步验证。然而，所提方法为同时测定DE和RTV提供了便捷、高效的分析程序，可用于所开发制剂的常规质量控制和溶出评价。