**Neopestalotiopsis sp.冠腐病侵染下草莓（Fragaria × ananassa）叶片气体交换的时间动态响应及Trichoderma的生防调控效应**

《Current Plant Biology》：Strawberry Fights Back: Temporal Gas Exchange Responses of Fragaria × ananassa to Crown Rot Caused by Neopestalotiopsis sp.

　　

草莓（Fragaria × ananassa）冠腐病由Neopestalotiopsis sp.引起，该病原菌侵染导致叶片气体交换在早期即出现下降；早期气体交换变化与气孔（stomata）贡献相一致；在侵染后期，仅气孔限制（stomatal limitation）不足以解释光合作用的下降；Trichoderma未能阻止侵染驱动的光合功能崩溃。研究人员假设冠部侵染会在病害发展早期诱导可测量的叶片气体交换变化，且碳同化（A）、气孔导度（gs）、蒸腾（E）与胞间CO₂浓度（Ci）之间的关系会随病程进展而改变。因此，本研究的主要目标是表征草莓Neopestalotiopsis冠腐病侵染后叶片气体交换的时间动态，并考察其与可见病害进展的关系；次要目标是评估本土Trichoderma分离株处理在病原胁迫下是否改变这些生理响应。

**研究背景与问题**　草莓（Fragaria × ananassa）为蔷薇科多年生草本植物，约60%的全球草莓产量来自该杂交八倍体物种，2021年全球产量超过918万吨，年市场价值估计超过184.1亿美元。草莓的叶、匍匐茎和生殖结构均起源于中央冠部（crown），冠部在维管运输中起关键作用，连接根系与地上组织并支撑水分、养分和碳通量，因此冠部受损可破坏维管完整性并影响系统性水分关系与光合性能。Neopestalotiopsis sp.原被视为次要病害，但近年来因严重暴发而受到关注，可造成广泛果斑和植株衰退，使美国佛罗里达州部分商业田块无法采收，并迫使种植者销毁整个生产区；该病原菌已迅速从苗圃相关病例扩散至美国多个州及世界其他草莓产区，在墨西哥田间条件下可致高达50%的产量损失。其侵染表现为叶斑、冠部坏死和根系恶化，受侵染种苗常在定植后短期内出现症状并可能在一个月内死亡。尽管该病原菌所致症状和产量损失已有充分记载，但其对宿主生理过程尤其是光合动态的影响仍知之甚少。光合动态反映碳同化随植物生理状态变化而随时间改变的过程，由于光合作用对胁迫高度敏感，碳同化的变化可能在一些宿主—病原系统中先于可见症状或广泛结构损伤而显现。气体交换测定可通过净光合速率（A）、气孔导度（gs）、蒸腾速率（E）和胞间CO₂浓度（Ci）的时间变化追踪这些响应：A下降伴随gs和Ci降低符合气孔限制增强，而A下降伴Ci稳定或升高则提示同化受非气孔过程制约，包括中观叶肉（mesophyll）CO₂扩散或叶绿体内碳固定受损。冠腐病的主要侵染位点与进行光合功能评估的叶片在空间上分离，根部或维管组织侵染可改变长距离水分运输和生理信号传导，进而影响远端叶片的气孔行为和光合功能。然而，尚无已知研究定量表征草莓Neopestalotiopsis冠部侵染相关的叶片气体交换时间动态，也不清楚叶片气体交换变化是否先于可见叶部症状，以及碳同化、气孔导度和胞间CO₂浓度之间的关系如何随病程演变。在此生理背景下，Trichoderma spp.是广泛研究的生物防治因子，对包括Neopestalotiopsis spp.在内的多种植物病原菌具有拮抗活性，并被报道可促进植物生长、诱导系统抗性并影响非生物胁迫下的光合性能，但这些生理效应在活跃的Neopestalotiopsis侵染期间能否持续、能否反映于叶片气体交换的时间动态仍不清楚。

**研究开展与结论**　研究人员开展了温室裂区析因试验（2 × 4），以侵染状态为整区因子（接种Neopestalotiopsis sp.与未接种对照），以Trichoderma处理为裂区因子（不施用、菌株T2、T9、T22），每处理组合5个生物学重复，整个试验在相同条件下独立进行两次；于接种前（0 dpi）及接种后1、3、7、14、21天对同一批植株重复测定气体交换。结果表明，接种后3 dpi侵染植株A较对照降低25%，而可见叶部症状首次出现于7 dpi，说明气体交换变化先于可见症状；早期gs与E在1–3 dpi即出现下降，Ci在此期间相对稳定，3 dpi时气孔限制指数（Ls）差异未达显著，这些响应与气孔参与早期碳同化下降相一致。至21 dpi，A下降约75%，gs和E分别下降约63%和64%，而Ci较14 dpi升高约36%，Ls下降约69%，表明降低的气孔CO₂进入已不能单独解释后期光合下降。Trichoderma处理未显著改变A、gs或E的主效应，未能在侵染下持续维持气体交换；在未侵染条件下菌株T22显著降低Ci和Ci/Ca并提高Ls，但未伴随净光合速率提高，且这些效应在侵染下未维持；21 dpi定量图像分析未发现Trichoderma处理间绿色冠层面积存在显著差异。

**主要关键技术方法**　研究采用裂区析因设计（2 × 4）并结合重复测量，试验于墨西哥Querétaro的Tecnológico de Monterrey（ITESM）温室开展；草莓材料为cv.‘San Andreas’，采自CAETEC田间植株并经离体组织培养繁殖，炼苗4周后用于接种；病原菌自症状植株冠部组织分离、单孢纯化并经柯赫氏法则验证致病性，以伤根法将1 × 10⁶ conidia mL^-1孢子悬液接种于冠部；三种本土Trichoderma菌株（T2、T9、T22，2020年分离自墨西哥Michoacán的Los Azufres森林土壤，经ITS、tef1和cal多位点序列确认属T. asperellum/asperelloides亚支）以土壤灌根方式每周施用；使用LI-6800便携式光合系统在受控条件下测定A、gs、E和Ci并计算Ci/Ca、Ls、内在水分利用效率（iWUE）和瞬时水分利用效率（WUE）；于21 dpi拍摄冠层图像，经MATLAB半自动分割流程以Excess Green指数（ExG）和Otsu法量化绿色冠层面积与绿色冠层比例；统计分析采用线性混合模型与Type III方差分析，并以Tukey检验进行事后比较。

**研究结果**

*3.1 病害严重度进展*　通过定期症状观察发现，接种后7 dpi首次出现细小的脉间褪绿斑点，随后发展为弥漫性褪绿镶嵌、局部坏死、红至红褐色斑点，最终叶片广泛坏死、严重干燥和结构崩溃，症状呈明显的时空梯度；可见叶部症状首次记录于7 dpi，而侵染与对照植株间净CO₂同化的显著差异在3 dpi即已检出。

*3.2 Neopestalotiopsis sp.侵染后叶片气体交换的渐进性破坏*　通过线性混合模型分析发现，A受侵染与时间强烈影响且二者交互显著（F(5,160) = 27.45，p < 0.001），3 dpi降低25%（p < 0.001）并持续至7 dpi（p = 0.019），14 dpi因对照植株下降而短暂趋同，21 dpi侵染植株降低75%（p < 0.001）；gs和E呈相似模式，1–3 dpi即可检测到下降，中期减弱，21 dpi再度强烈下降；Trichoderma处理未显著改变A、gs和E主效应（均p > 0.100）。Ci不受侵染单因素影响（p = 0.461），但侵染×时间交互显著（F(5,192) = 8.84，p = 1.44 × 10^-7），14 dpi出现分异并于21 dpi明显；Ci/Ca和Ls呈相似时间动态，二者侵染主效应不显著（p > 0.350）但交互显著（p < 0.001），差异主要在21 dpi显现，3 dpi时Ls差异未达显著（p = 0.052）；iWUE和WUE均未受显著影响（均p > 0.330）。

*3.3 Trichoderma处理对内部碳参数和植株完整性的影响*　通过混合模型分析发现，Trichoderma处理对A、gs和E无显著主效应，未提供其在评估条件下持续改善净光合、气孔导度或蒸腾的证据；但显著影响Ci、Ci/Ca和Ls（均p < 0.01），该效应主要由未侵染条件下的菌株T22驱动（Ci和Ci/Ca差异p < 0.01，Ls差异p = 0.027），侵染下菌株间无显著差异，且A和gs无相应处理效应。21 dpi图像定量分析显示，侵染下Trichoderma处理间绿色冠层面积无显著差异（F(3,16) = 1.16，p = 0.357），合并为一类后与未处理侵染植株相比亦无显著差异（Welch t检验，p = 0.463），提示后期视觉差异可能反映结构崩溃模式而非实际绿色冠层面积的保持。

**讨论与结论**　讨论部分指出，冠部接种后由脉间褪绿向广泛坏死的时间进展提示冠部侵染与远端叶片的渐进性恶化相关，因接种位于冠部而非叶部，后续远端叶部症状的发展与冠部侵染的系统性响应相一致，但确认维管功能障碍机制仍需木质部定殖和植株水力状态的直接测定；随症状加剧出现的红色色素沉着在其他作物中与花青素和酚类代谢改变相关，但本研究的色素沉着生化基础未予评估。气体交换结果显示时间上截然不同的生理响应：早期gs和E在1–3 dpi即下降而A在3 dpi显著降低，Ci相对不变且3 dpi时Ls差异未达显著，与气孔参与早期碳同化下降相一致，但其具体贡献无法由现有测定量化；研究人员指出早期气孔关闭在草莓真菌侵染中已有报道，但本研究不能确立其在本冠部接种系统中具有相同防御功能，且iWUE和WUE无显著变化本身不能证明存在调控性气孔控制或驯化。A在3 dpi即显著低于对照而可见症状首现于7 dpi，这一时间差揭示了仅凭可见症状描述无法捕捉的冠腐病进展特征。21 dpi时A下降约75%、gs和E分别下降约63%和64%，而Ci较14 dpi升高约36%、Ls下降约69%，表明严重碳同化下降发生于更高的胞间CO₂浓度和更低的推断气孔限制之下，仅气孔CO₂进入减少已不能解释后期光合下降；但Ci升高不能识别具体过程，该模式与气孔CO₂进入之外过程贡献增加相一致，可能涉及叶肉扩散、光化学过程、生化碳固定或其组合，现有测定无法区分，定量分离气孔、叶肉和生化限制需A/Ci响应曲线、叶绿素荧光及叶肉导度和叶绿体CO₂浓度（Cc）估算等补充方法。关于Trichoderma，研究人员指出体外观察到的有希望拮抗响应未能在活体转化为持续的生理保护，每周土壤灌根未能阻止后期气体交换下降；一种可能解释是侵染的冠部属性，在涉及根、冠或茎侵染的其他病理系统中，水分运输和植株水力功能改变与气孔导度和碳同化下降相关，病原诱导的维管功能障碍可能压倒了Trichoderma介导的光合代谢改善所带来的生理益处，气体交换结果未识别Trichoderma效应有限的机制，但表明其任何生理益处均不足以在病程中维持A、gs或E；未侵染条件下T22降低Ci和Ci/Ca并提高Ls而未提高净光合速率，这些变量不提供叶肉导度（gm）或叶绿体CO₂浓度信息，故不能判断叶肉扩散或生化过程是否改变，且这些效应在侵染下未观察到；未检测到稳健的侵染×Trichoderma×时间交互，提示处理效应未从根本上改变气体交换对侵染响应的时间轨迹；尽管部分Trichoderma处理植株在侵染后期外观冠层结构更完整，客观测定未显示功能保持，气体交换参数未显示光合活性的持续维持，21 dpi图像定量分析亦未发现绿色冠层比例在处理间存在显著差异。结论部分指出，本研究结果揭示了草莓Neopestalotiopsis冠腐病侵染后时间上截然不同的生理响应：早期病害发展以净光合、气孔导度和蒸腾的协同下降为特征，且可测量的叶片气体交换改变先于可见叶部症状出现；在病害后期，严重碳同化下降伴随胞间CO₂浓度升高和气孔导度降低，表明仅气孔CO₂进入减少可能不能完全解释所观察到的光合下降；这些发现证明气体交换参数之间的关系随病程演变，尽管现有测定无法区分潜在的光合限制机制。作为次要目标，Trichoderma处理产生有限的生理效应，未能在侵染下持续维持气体交换性能。本研究将Neopestalotiopsis冠腐病的认识从可见病害症状拓展至远端叶片的生理破坏可先于叶部症状发展、且气体交换关系随侵染进展发生实质性改变，为草莓冠腐病提供了时间性生理视角，并为未来研究其潜在机制及探索早期叶片气体交换变化能否在可见叶部症状出现前用于病害监测奠定了基础。