桑育水稻根际促生菌的分离筛选与基于16S rRNA扩增子测序的群落分析

《Current Research in Biotechnology》：Isolation and screening of plant growth-promoting rhizobacteria for Sangyod rice using 16S rRNA amplicon sequencing analysis

　　

桑育水稻（Sangyod rice）是泰国南部博他仑府（Phatthalung Province）出产的一种深红紫色色素水稻品种，富含多种营养物质和生物活性化合物。本研究采用16S rRNA扩增子测序技术，分析了有机栽培（n=4）和化学栽培（n=3）桑育水稻根际土壤及水葫芦堆肥（n=4）中的根际细菌群落，并通过功能预测、定向分离、促生性状（PGP traits）筛选、分子鉴定及细菌相容性测试，筛选具有促生潜力的根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR）。α多样性分析表明，有机与化学栽培土壤的细菌多样性相近，而堆肥中的多样性显著较低。β多样性分析显示三组样本的群落组成存在显著差异（PERMANOVA，FDR<0.05）。功能基因簇预测发现，Bradyrhizobium hipponense和Rhodoblastus acidophilus同时携带完整的固氮基因簇（nifH、nifE、nifK、nifD、nifN、nifB）和溶磷相关基因簇（pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE）。通过营养琼脂（NA）和酵母膏甘露醇（YEM）琼脂定向分离，共获得20株具有固氮、溶磷和IAA产生能力的菌株。其中，Lysinibacillus xylanilyticus（SAN32）表现出最高的溶磷指数（phosphate solubilization index, PSI=3.72），Bacillus aerius（SAN29）的IAA产量达63.54 mg/L，且与L. xylanilyticus和Lysinibacillus capsici（SAN30）具有良好的生物相容性。16S rRNA Sanger测序和系统发育分析确认了菌株的分类地位。Paraburkholderia kururiensis在扩增子测序和Sanger测序数据中均被检出，Bacillus和Priestia属也同时出现在两种测序结果中。本研究整合了培养非依赖与培养依赖的方法，为桑育水稻根际促生菌的筛选和生物肥料的开发提供了重要依据。

论文解读

一、研究背景与意义

水稻是亚洲多国的主粮作物，具有重要的经济价值。泰国高度重视水稻生产以保障粮食安全，其中桑育水稻是泰国南部博他仑府特有的深红紫色色素水稻品种，富含维生素E、B1、B2、B6以及碳水化合物、膳食纤维、蛋白质等营养成分，并含有钙、磷、铁等必需矿物质以及γ-氨基丁酸（GABA）和γ-谷维素（γ-oryzanol）等生物活性化合物。γ-谷维素对心血管系统有益，可能降低低密度脂蛋白胆固醇水平，这些营养和功能特性推动了桑育水稻在国内外市场需求的持续增长。

为满足日益增长的需求，部分农民使用化学肥料以在短期内获得更高产量。然而，长期施用化学肥料会导致土壤板结、必需养分耗竭以及重金属积累增加，进而污染农产品。此外，过量施用氮肥可导致作物和地下水中硝酸盐积累，与高铁血红蛋白血症和癌症风险增加等潜在健康问题相关。有机肥料更安全、更健康且更可持续，因其主要由分解的有机质组成，可增强微生物活性并改善土壤结构。但有机种植体系的水稻产量可能不足以满足快速增长的需求，且有机产品通常价格更高、可及性不如常规种植水稻。

在此背景下，与有机种植体系相关的植物促生根际细菌（PGPR）已成为化学肥料、农药和合成补充剂的 promising 替代方案。PGPR是通过多种机制促进植物生长的有益根际细菌，包括生物固氮、溶磷和植物激素吲哚-3-乙酸（IAA）的合成。此外，PGPR还能减少水稻中的砷积累并增强对盐胁迫的耐受性，从而提高作物韧性。然而，传统依赖培养的方法存在局限性——据估计，使用标准实验室技术可培养的土壤微生物不足1%。为克服这些限制，16S rRNA扩增子测序作为一种不依赖培养的方法被开发出来，能够全面分析微生物群落。此前已有研究利用ITS扩增子测序表征了桑育水稻种植土壤中的真菌群落，但桑育水稻根际的细菌群落此前从未被表征。因此，本研究首次对桑育水稻根际细菌群落进行了系统分析。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员从泰国博他仑府塔莫县（Tamot District）的有机栽培稻田（4个样本O1–O4）和化学栽培稻田（3个样本C2–C4）的约20 cm深度根际土壤，以及Bioaxel有限公司提供的水葫芦堆肥（4个样本F1–F4）中采集样本。研究采用的主要关键技术方法包括：利用ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit提取总基因组DNA，在DNBSEQ-G400RS平台进行16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序（每样本约40,000条reads）；使用QIIME 2和DADA2进行生物信息学分析，生成扩增子序列变异体（ASVs），并利用四个参考数据库（Greengenes full-length、Greengenes V4、SILVA full-length、SILVA V4）进行物种分类；通过BLASTN和BLASTP进行功能预测，筛查固氮基因（nif）簇和吡咯喹啉醌基因（pqq）簇；采用营养琼脂（NA）和酵母膏甘露醇（YEM）琼脂进行细菌定向分离；通过Jensen无氮培养基、Pikovskaya琼脂和Salkowski试剂分别评估固氮、溶磷和IAA产生能力；利用16S rRNA Sanger测序进行分子鉴定；通过共培养法评估细菌生物相容性；使用MEGA12构建最大似然（ML）系统发育树。

三、研究结果

3.1 桑育水稻根际细菌群落组成

16S rRNA扩增子测序共获得每样本21.51–21.94 Mbp的原始数据，测序深度约40,000×，数据质量一致较高。属水平分类分析显示，有机和化学栽培土壤的根际细菌群落结构总体相似。使用Greengenes full-length数据库分类时，Mycobacterium是最丰富的已鉴定属（有机6.51%；化学4.73%），其次是Aquisphaera（有机3.65%；化学2.17%）、Anaerolineales bacterium UBA4142和Bradyrhizobium，但有机和化学土壤中均有大量序列未被注释（分别占45.01%和42.01%）。相比之下，水葫芦堆肥中的群落结构截然不同，以嗜热属为主，包括Saccharomonospora（36.21%）、Oceanobacillus（20.52%）、Caldibacillus sp. 295,372（13.31%）和Planifilum（6.58%），未注释序列仅占5.75%。物种水平分析显示，有机和化学土壤中已鉴定物种仅占群落的一小部分，大部分序列未注释（Greengenes full-length数据库中分别占74.07%和67.69%），堆肥中Saccharomonospora viridis是最丰富的物种（35.79%）。

3.2 α多样性与β多样性分析

α多样性分析表明，在所有四个参考数据库中，有机和化学栽培土壤的细菌多样性相近，Shannon H′指数在有机组为3.83–3.99，化学组为3.94–4.08；Simpson 1?D指数在有机组为0.958–0.967，化学组为0.964–0.973。水葫芦堆肥的细菌多样性在所有数据库中均显著较低，Shannon H′指数为2.06–2.31，Simpson 1?D指数为0.782–0.802。β多样性分析显示，三组样本的根际细菌群落存在显著差异，样本沿Axis 1（解释85.3%的变异）清晰分离，堆肥组与有机和化学组形成明显不同的聚类。两两PERMANOVA确认所有三组比较均显著不同（FDR<0.05），堆肥与有机（R2=0.918）和堆肥与化学（R2=0.926）比较的效应量大于有机与化学比较（R2=0.363）。

3.3 基于生物信息学的促生能力预测

研究人员通过基因组功能分析预测了检测到的分类群的促生潜力。在Greengenes full-length数据库中，Roseiarcus fermentans、Bradyrhizobium hipponense、Rhodoblastus acidophilus和Rhodopila globiformis携带完整的nif基因簇（nifH、nifE、nifK、nifD、nifN、nifB），表明可能具有生物固氮潜力；Betaproteobacteria bacterium GCA_020354125.1和Komagataeibacter saccharivorans携带完整的pqq基因簇（pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE），表明可能具有溶磷潜力。值得注意的是，Bradyrhizobium hipponense和Rhodoblastus acidophilus同时携带完整的nif和pqq基因簇，表明具有固氮和溶磷的双重潜力。在Greengenes V4数据库中，Rhodoblastus sphagnicola和Rhodopila globiformis携带完整固氮基因簇，Komagataeibacter saccharivorans和Reyranella soli携带完整pqq基因簇。SILVA full-length和SILVA V4数据库的分析结果进一步支持了Rhodoblastus acidophilus和Komagataeibacter saccharivorans的功能潜力。

3.4 PGPR的分离、筛选与鉴定

基于功能预测结果，研究人员采用NA和YEM琼脂进行平行定向分离。从NA琼脂获得的菌株以SAN前缀命名，从YEM琼脂获得的菌株以SAY前缀命名。所有SAN菌株均能在无氮培养基上生长并表现出溶磷活性，其中Lysinibacillus xylanilyticus（SAN32）的溶磷指数（PSI）最高（3.72），其次是Lysinibacillus capsici（SAN30，PSI=3.37）。在IAA产生方面，Lysinibacillus macroides（SAN55）产量最高（130.78±22.44 μg/mL），Bacillus aerius（SAN29）排名第二（63.54±0.89 μg/mL）。所有SAY菌株也均能在无氮培养基上生长，Bacillus aerius（SAY1）表现出最高的PSI（1.60），Paraburkholderia kururiensis（SAY14）的IAA产量最高（37.72±1.85 μg/mL）。16S rRNA Sanger测序鉴定出多种菌株，包括Bacillus aerius、Bacillus pacificus、Lysinibacillus capsici、Lysinibacillus xylanilyticus、Lysinibacillus macroides、Priestia aryabhattai、Burkholderia paludis、Burkholderia aenigmatica、Burkholderia ambifaria和Paraburkholderia kururiensis等。值得注意的是，Paraburkholderia kururiensis在扩增子测序和Sanger测序数据中均被检出，Bacillus和Priestia属也同时出现在两种测序结果中。

3.5 细菌生物相容性

研究人员选取PSI最高的两株菌（Lysinibacillus xylanilyticus SAN32和Lysinibacillus capsici SAN30）以及IAA产量最高的两株菌（Lysinibacillus macroides SAN55和Bacillus aerius SAN29）进行生物相容性评估。共培养实验表明，SAN55（L. macroides）与SAN32和SAN30在所有组合中均形成抑菌圈，表现为不相容；而SAN29（B. aerius）与SAN32和SAN30在所有组合中均未形成抑菌圈，表现为完全相容。

3.6 系统发育分析

最大似然（ML）系统发育树解析出两个主要分支，分别对应Bacillus属和Lysinibacillus属（两者bootstrap值均为100%）。SAN29聚在Bacillus分支内，与Bacillus aerius strain 24K（NR_118439.1，100%一致性）最接近；SAN32聚在独立的Lysinibacillus分支内，与Lysinibacillus xylanilyticus（NR_116698.1，87.22%一致性）最接近。两个分支形成独立谱系，树拓扑无重叠，且均明显区别于外群，证实SAN29和SAN32代表遗传上不同的分类单元，与培养依赖的16S rDNA Sanger测序结果一致。

四、讨论与结论

讨论部分指出，α多样性分析显示化学施肥土壤的细菌多样性在各参考数据库中均略高于有机施肥土壤，这一模式偏离了有机土壤管理通常支持更高细菌多样性的公认原则。研究人员认为，这可能与化学施肥土壤中特定营养条件对某些细菌类群的选择性富集有关，也可能反映了有机土壤中未培养微生物的比例更高。β多样性分析则清楚表明，堆肥中的细菌群落与水稻根际土壤存在本质差异，这主要归因于堆肥过程中的高温阶段筛选出了嗜热菌群。

研究结论可概括为：本研究首次系统表征了桑育水稻根际细菌群落，发现有机和化学栽培土壤的细菌多样性相近，而水葫芦堆肥的多样性显著较低。通过整合16S rRNA扩增子测序、功能预测、培养依赖分离、促生性状筛选、分子鉴定和细菌相容性测试，研究人员成功筛选出多株具有促生潜力的菌株。其中，Lysinibacillus xylanilyticus（SAN32）具有最高的溶磷能力（PSI=3.72），Bacillus aerius（SAN29）具有较高的IAA产量（63.54 mg/L）且与L. xylanilyticus和L. capsici相容，可作为开发桑育水稻微生物菌肥的候选菌株。此外，Paraburkholderia kururiensis在两种测序方法中均被检出，Bacillus和Priestia属的一致性也验证了培养依赖与培养非依赖方法的互补性。该研究为桑育水稻可持续生产提供了潜在的生物肥料资源，也为其他作物根际促生菌的筛选提供了方法学参考。