《Briefings in Bioinformatics》：A single-cell transcriptomic method for the deconvolution of multi-donor blood mixtures
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从多供者生物混合物中识别个体供者在法医学中仍然具有挑战性，尤其是对于同组织样本。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）通过细胞分离保留了单个个体的遗传变异，提供了一种有前景的解决方案。然而，目前缺乏针对法
从多供者生物混合物中识别个体供者在法医学中仍然具有挑战性，尤其是对于同组织样本。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）通过细胞分离保留了单个个体的遗传变异，提供了一种有前景的解决方案。然而，目前缺乏针对法医混合物分析流程的系统评估。本研究提出并系统评估了一个无需供者参考的解卷积框架，应用于复杂的三供者和五供者外周血混合物。为克服转录组稀疏性和技术噪声，研究人员实施了一种两阶段过滤策略，将基于FreeBayes的群体水平伪批量变异预筛选与基于CellSNP-lite的单细胞水平基因分型相结合。该方法有效清除了假阳性候选单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs），使单细胞矩阵密度翻倍，并将高深度位点数量提升近七倍。当与Vireo算法整合后，优化的上游数据质量提高了下游遗传差异分数，从而实现清晰的个体解卷积。独立的全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）验证了该框架，显示出高基因型一致性，并产生了远超传统法医鉴定阈值的强大似然比。此外，解卷积后的单细胞图谱能够实现可靠的跨样本供者匹配，并展示出与所有参与贡献者已知东亚背景一致的生物地理祖先分配。本概念验证研究建立了一个经过验证的实用框架，用于解决同组织血液混合物问题，为单细胞转录组学在法医遗传学中的应用提供了基础基线。
一、研究背景与科学问题
在法医学实践中，生物检材常呈现为复杂的多人混合样本。当前，短串联重复序列（short tandem repeat, STR）分型是个人识别的金标准。然而，即便借助概率基因分型模型，混合STR图谱的极端复杂性仍限制了其在复杂混合物分析中的应用，并且这种方法通常无法支持进一步的扩展法医调查，如生物地理祖先推断。为解决这些局限，研究者开发了多种标记特异性靶向策略和样本预处理方法，包括差异提取、Y染色体检测以及缺失/插入多态性与STR或SNP的复合标记配对。尽管这些方法在常规案件中提升了分析特异性，但在遇到复杂的多人、同性生物混合物时表现出严重的操作边界。具体而言，Y染色体检测对女性-女性混合物天然无效，且由于父系共享谱系无法在多男性混合物中实现个体水平区分，而常染色体STR则常受等位基因掩蔽影响。因此，传统的靶向DNA位点往往缺乏必要的遗传信息密度和多维性来分辨重叠的同性别贡献者。
近年来，法医RNA分析引入了多维视角；除常规组织类型鉴定外，转录本内单核苷酸多态性（RNA-SNP）的表征使得同时确定体液类型并从混合物中推断供者身份成为可能。然而，一个关键限制依然存在：这种批量转录组数据本质上聚合了数千个细胞的分子信号。当多个个体贡献了同一种体液时，这种集体平均化使得批量RNA测序不足以解卷积复杂混合物。与此同时，从细胞分离角度也发起了多项动态尝试，但现有方法如荧光激活细胞分选、DEPArray?、激光捕获显微切割和光镊等技术要求高且常受限于低细胞产量。虽然基于微流控的单细胞RNA测序（scRNA-seq）克服了这一局限，实现了高通量的细胞水平SNP信息提取，但目前明显缺乏专门针对scRNA-seq混合物的结构化法医数据分析流程。因此，迫切需要构建专门的生物信息学流程，以适应法医遗传学的特定需求。
不同于利用实验前细胞哈希或依赖参考工具（如Demuxlet）的临床单细胞多重分析，真实的法医证据在没有先验供者基因型或实验条形码的情况下出现。解析此类未经表征的同组织混合物需要一种无监督、无需供者参考的解卷积范式。
二、研究内容与主要发现
本研究描述、优化并验证了一个全面的生物信息学流程，用于使用scRNA-seq对同组织血液混合物进行解卷积，且无需事先了解供者的基因组图谱。利用以质量为中心的两阶段单细胞RNA-SNP过滤过程，研究人员将变异发现与Vireo的贝叶斯模型相结合，实现了稳健的多人分离。研究人员通过成功匹配独立血液混合物中的重叠个体，并对照真实全基因组测序（WGS）数据验证推断基因型的准确性，展示了该流程的效率，显示出高基因型一致性。最后，研究人员评估了所提取SNP的法医学效用，这些SNP表现出强大的个体区分能力和与供者已知东亚背景一致的生物地理祖先推断。作为一项初步的概念验证研究，该框架整合了血液混合物解卷积、个体识别和祖先推断，从而为将单细胞转录组学应用于法医生物混合物分析建立了基础的方法学基线。
三、关键技术方法
研究人员采用了三种不同的计算流程来生成用于Vireo的SNP信息。流程1直接使用CellSNP-lite在单细胞水平进行SNP基因分型。流程2在流程1的基础上增加了Scrublet双联体过滤步骤。流程3实施了核心的两阶段策略：首先，在Scrublet双联体过滤后，使用FreeBayes对整合的单细胞BAM文件进行群体水平的伪批量变异筛查，生成高质量的先验SNP集；随后，以此定制参考VCF文件，使用CellSNP-lite进行单细胞水平基因分型。所有流程最终均生成等位基因深度矩阵，输入到供者解卷积软件Vireo和Freemuxlet中。样本来源于山西医科大学伦理委员会批准的5名无关健康志愿者，采集外周静脉血并按等比例混合制备了三供者和五供者样本。
四、研究结果
单细胞RNA测序结果概述
为基准测试解卷积算法，研究人员制备了两个混合血液样本：一个包含来自三名健康供者的外周静脉血，另一个包含五名健康供者。五供者样本包含了与三供者样本相同的三名供者，以实现后续交叉验证。经MobiCube平台测序和初步分析，三供者混合物包含13663个细胞，五供者混合物包含13528个细胞。基因组比对率分别为96.26%和97.58%，每个细胞的中位基因数分别为1082和1055。
不同解复用软件性能比较
研究人员在等比例混合设计下比较了Vireo和Freemuxlet的供者分配结果。通过对UMAP图上供者分配的可视化和按细胞类型的供者比例量化，立即揭示了Freemuxlet的系统性偏差。例如，在细胞毒性CD8?T细胞中，Freemuxlet将69.6%的细胞分配给单一供者，严重偏离预期的约33.3%。相比之下，Vireo的分配看起来均匀分布。统计评估显示，在三供者混合物中，Freemuxlet在11种细胞类型中有9种表现出高度显著的非均匀分布，而Vireo在所有细胞类型中均未表现出显著偏离均匀性。在更复杂的五供者混合物中，这一趋势被放大。基于Vireo更均匀的供者分配和更小的效应量，研究人员将其解卷积图谱用于下游分析。
单细胞转录组混合物解卷积流程基准测试
为获得高质量的SNP图谱，研究人员评估了三个计算流程的性能。流程3整合了FreeBayes的群体水平伪批量变异检测，使输入Vireo的候选SNP数量大幅减少约94%，同时使矩阵密度翻倍，并使高深度位点比例提升近七倍。这种结构性改进直接提升了下游贝叶斯聚类的个体遗传差异分数，流程3的遗传差异分数提高到0.34-0.37，远高于流程1和2的0.13。通过过滤保留高置信度SNP，研究人员获得了2097个共享SNP，其中1968个可用于区分个体。配对基因型一致性和Spearman相关系数矩阵在两个独立实验中明确识别出三个高置信度的重叠供者匹配，得分均超过0.95，而所有其他跨样本供者对的基础相似性低于0.46。
个体遗传鉴定
为独立评估推断基因型的准确性，研究人员将五个独特供者的scRNA-seq衍生的SNP图谱与其对应的真实WGS数据进行了比较。正确匹配供者的基因型一致率（包括等位基因丢失）范围为91.2%至95.5%，而所有非匹配供者的一致率低于53.5%。为量化个体识别的证据价值，研究人员使用东亚人群中最小等位基因频率≥0.3的一致性SNP计算了似然比。正确匹配供者的LR值在低深度WGS样本中范围为101?·3至102?·1，在高深度WGS样本中范围为103?·1至10??·?，均远超设定的log??(LR)=15的阳性个体认定阈值。所有非匹配比较的LR值均低于101?。
生物地理祖先推断
研究人员鉴定了337个祖先信息SNP（AISNPs）。STRUCTURE分析和主成分分析正确地将所有八个解卷积后的个体图谱分配至东亚集群，与其已知祖先一致。
五、讨论与结论
本研究建立了一个经过验证的稳健计算流程，用于使用scRNA-seq数据解卷积同组织血液混合物中的个体供者。系统性基准测试突出了两个关键成功因素：以质量为中心的SNP过滤策略和对转录异质性稳健的解复用算法。通过观察，Vireo的变分贝叶斯框架产生的供者细胞分布与健康生理参考区间大致兼容，而Freemuxlet在缺乏先验变异筛查时表现出显著的细胞类型相关分配偏斜，这可能归因于免疫受体转录本的极端表达水平和体细胞超变异性等因素。研究结果表明，在稀疏scRNA-seq数据上进行直接的细胞水平SNP调用不足以实现最佳解复用。流程3的改进性能源于其整合的端到端处理策略，通过初始伪批量变异调用步骤有效区分了真正的遗传变异与技术噪声。与现有替代方法相比，该流程在细胞分辨率上隔离遗传数据，无需先验供者参考基因型。通过WGS数据的独立验证，证明了高基因分型一致性和远超常规鉴定阈值的似然比，将该流程转变为经验验证的概念验证框架。所提取的SNP还实现了与供者已知东亚背景一致的生物地理祖先分配。
研究结论：本研究建立了一个连接单细胞转录组学和法医遗传学的经过验证的概念验证框架，用于解析同组织生物混合物。虽然在投入实际应用之前仍需在具有挑战性的案件条件下进行广泛验证，但该工作流程为单细胞混合物解卷积以及在无需先验供者参考基因型的更广泛生物医学应用中提供了基础方法学基线。
