空间转录组数据反卷积方法在细胞类型错配情况下的稳健性系统评估

《Briefings in Bioinformatics》：Systematic evaluation of robustness of deconvolution methods for spatial transcriptomics data in case of cell type mismatch

　　

摘要专业翻译 基于测序的空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）保留了空间信息但细胞分辨率有限，而单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）提供单细胞分辨率，但在组织解离过程中丢失空间背景。鉴于这些互补优势，计算方法利用scRNA-seq参考数据，通过反卷积（deconvolution）识别细胞类型并估计每个空间位置处的细胞类型比例。然而，这些方法对参考数据中缺失的细胞类型敏感，这一问题被称为细胞类型错配（cell type mismatch）。研究人员利用两个参考数据集，进行了广泛的模拟，系统评估了八种反卷积方法对细胞类型错配的稳健性，其中包括六种专门为ST数据设计的方法（CARD、cell2location、RCTD、Seurat、SPOTlight和Stereoscope），以及两种为批量RNA-seq数据设计的方法（MuSiC、SCDC）。在基线条件下，即参考数据集中没有缺失细胞类型时，cell2location表现出最强的性能，而Seurat表现最差。通过模拟不同的细胞类型错配场景，研究人员发现反卷积方法的性能与参考数据中缺失的细胞类型数量成比例下降。此外，与基线相比，各方法的性能相对下降幅度相似，因此没有一种方法比其他方法对细胞类型错配更具稳健性。另外，基线表现良好的方法倾向于将缺失细胞类型的比例分配给参考数据中转录组最相似的细胞类型。研究结果凸显了细胞类型错配对ST数据反卷积方法性能的不利影响，并强调需要开发对此问题更具稳健性的方法。

论文解读

一、研究背景与问题

空间转录组学技术近年来发展迅速，主要分为两大类：基于成像的技术能够实现单细胞分辨率但仅能检测有限的转录本；基于测序的技术能够生成全转录组的基因表达谱，但无法达到单细胞分辨率，其每个空间位置（spot）的测量值可能代表多个不同细胞类型的混合表达。因此，如何确定每个spot中不同细胞类型的比例成为核心挑战。基于参考的反卷积方法利用scRNA-seq参考数据与ST数据相结合来估计细胞类型比例，这类方法已在批量RNA-seq数据中应用多年，专门为ST数据设计的方法通常优于为批量RNA-seq开发的方法。

然而，参考-based方法依赖于匹配的scRNA-seq数据，对参考数据或ST数据中细胞类型的缺失十分敏感，这一问题称为细胞类型错配。在实际研究中，由于实验方案和测量特征的差异，某些细胞类型可能在组织解离过程中丢失或在参考数据中缺失，导致参考数据不完整。已有研究仅针对个别方法或少数缺失细胞类型的场景进行了评估，尚缺乏对反卷积方法在细胞类型错配下稳健性的系统评价。因此，研究人员开展了本研究，旨在系统量化多种ST反卷积方法在不同错配严重程度下的稳健性趋势。

二、研究内容与结论

研究人员利用两个人类淋巴结scRNA-seq数据集构建了整合参考数据集，包含13种细胞类型共3519个细胞，并以人类下丘脑单核数据集作为独立验证集。研究人员开发了ST数据模拟算法，生成了具有已知真实细胞类型比例的模拟ST数据集，系统评估了八种参考-based反卷积方法的性能，包括六种专门为ST设计的方法（CARD、cell2location、RCTD、Seurat、SPOTlight、Stereoscope）和两种为批量RNA-seq设计的方法（MuSiC、SCDC）。研究通过从参考数据中系统地移除一个或多个细胞类型来模拟错配场景，使用Jensen-Shannon散度（JSD）和均方根误差（RMSE）作为性能指标，并定义了细胞类型重新分配值（reassignment value）来量化缺失细胞类型的比例被重新分配到哪些剩余细胞类型。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：利用Seurat的anchor-based工作流整合两个淋巴结scRNA-seq数据集构建参考数据集；开发ST数据模拟算法，从参考数据集中直接抽样生成具有已知真实细胞类型比例的模拟ST数据，每个模拟数据集包含1600个spot，按40×40网格排列，模拟10× Visium测序深度；使用JSD和RMSE两种指标评估预测比例与真实比例的一致性；定义重新分配值以量化缺失细胞类型比例在剩余细胞类型间的重新分配情况。参考数据来源包括Tabula Sapiens Consortium淋巴结数据（53,275个细胞）和淋巴结基质细胞数据集（13,850个细胞），以及人类脑细胞图谱的下丘脑单核数据集。

四、研究结果

反卷积方法在基线性能上存在显著差异。 在基线场景下，即参考数据和ST数据包含相同细胞类型时，研究人员通过模拟数据集ST1评估了八种方法的性能。表现最好的三种ST特异性方法是cell2location、RCTD和CARD，其JSD中位数分别为0.11、0.14和0.16，RMSE中位数分别为0.05、0.07和0.07。两种批量RNA-seq方法SCDC和MuSiC表现居中，JSD中位数分别为0.27和0.29。表现最差的是Stereoscope、Seurat和SPOTlight，JSD中位数分别为0.33、0.43和0.49。逐细胞类型分析显示，某些细胞类型如肌细胞和骨骼肌细胞在所有方法中均更具挑战性，SPOTlight的低准确性主要由成纤维细胞比例估计错误驱动。

性能随参考数据中缺失细胞类型数量成比例下降。 研究人员系统地从参考数据中移除1、2、3、5、10或11个细胞类型，并计算与基线场景的spot-wise性能差异（ΔJSD、ΔRMSE）。结果显示，反卷积性能随缺失细胞类型数量的增加而成比例下降，这一趋势在基线表现最好的方法（cell2location、RCTD、CARD）中高度一致。基线表现较差的方法（Stereoscope、Seurat、SPOTlight）性能下降幅度较小，原因是其基线性能已经很低，下降空间有限。值得注意的是，CARD在参考数据仅剩两种细胞类型时无法执行，Seurat在参考数据仅剩两种或三种细胞类型时无法找到锚点。

缺失细胞类型的比例被分配给转录组相似的细胞类型。 研究人员通过重新分配值分析发现，基线表现好的方法（cell2location、RCTD、CARD）在缺失单一细胞类型时呈现相似趋势：脂肪细胞的比例主要重新分配给肌细胞，CD4 T细胞主要重新分配给CD8 T细胞，CD8 T细胞较均匀地重新分配给CD4 T细胞和NK细胞，内皮细胞和成纤维细胞主要重新分配给脂肪细胞，巨噬细胞主要重新分配给单核细胞，肌细胞较均匀地重新分配给脂肪细胞和骨骼肌细胞，NK细胞主要重新分配给CD8 T细胞，骨骼肌细胞主要重新分配给肌细胞。这些重新分配模式与细胞类型间的转录组表达相关性一致，例如CD4 T细胞与CD8 T细胞的相关系数为0.98。基线表现差的方法则呈现完全不同的模式，缺失细胞类型的比例往往被重新分配给多个不同细胞类型，且伴随多种细胞类型比例的显著下降。

下丘脑数据集验证结果。 研究人员使用下丘脑单核参考数据集作为独立验证，结果基本确认了淋巴结数据的主要结论：基线性能存在显著差异，cell2location仍为表现最好的方法；性能随缺失细胞类型数量成比例下降；缺失细胞类型被分配给转录组相似的细胞类型。但重新分配模式在下丘脑数据上比淋巴结数据更为分散，且方法排名的部分细节存在数据集依赖性，如MuSiC在下丘脑数据上表现改善而RCTD略有下降。

五、讨论与结论

研究讨论指出，当前ST数据反卷积方法在细胞类型错配这一常见场景下缺乏稳健性。虽然cell2location和RCTD能够显式建模平台效应，但由于模拟ST数据直接来自同一参考数据，平台差异极小，因此这不能解释其良好表现。Stereoscope虽然包含专门的"dummy"细胞类型组件用于吸收错配效应，但基线性能仍显著低于cell2location和RCTD，说明理论上的建模组件并不保证实际性能。研究还指出，模拟方法未考虑spot间的空间相关性，这可能低估了CARD在真实组织中的性能。研究人员建议通过裁剪ST数据排除仅存在于ST数据中的细胞类型区域，或利用分选的scRNA-seq数据构建细胞混合物来预测空间细胞组成，但这些方法仍需对组织结构和细胞类型组成有先验知识。研究最终强调，需要开发对细胞类型错配更具稳健性的通用参考-based反卷积方法。

研究结论可概括为：基线条件下反卷积准确性存在明显差异，cell2location表现最优；没有任何一种反卷积方法对细胞类型错配比其他方法更稳健，因为错配条件下的相对排名主要由基线性能决定，这揭示了当前反卷积策略的根本脆弱性；在表现最好的方法中，缺失细胞类型被重新分配给转录组相似的细胞类型，这突显了可预测的行为特征，同时也表明需要开发更稳健的方法。