基于原位紫外光谱与动态光散射的动力学溶解度评价方法比较研究

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Evaluating Kinetic Solubility – A Comparative Study of Analytical Approaches Using UV-based Evaluation Methods

　　

基于过饱和的制剂策略被广泛用于提高难溶性药物的口服生物利用度，然而沉淀起始点（动力学溶解度）的准确识别仍然依赖于所用方法且缺乏标准化。本研究采用原位紫外光谱（in situ UV spectroscopy）和动态光散射（DLS），对8种模型化合物的动力学溶解度进行了系统考察，紫外数据分别采用基线抬升（baseline elevation）、二阶导数分析（second-derivative analysis）和零截距法（zero-intercept method，ZIM）进行评价。基线抬升法与二阶导数法表现出高度一致性，在对应于形成光学可检测颗粒的相近浓度处检测到沉淀。相比之下，ZIM始终在较低浓度处识别出转变，表明其对早期聚集事件具有更高灵敏度。DLS测定证实，在对应于ZIM检测终点的浓度下存在颗粒，支持其与相分离初始阶段的关联。在某些情况下观察到液-液相分离（LLPS），ZIM在可见液滴出现之前即可检测到早期相转变。比较性统计分析证明，二阶导数法和基线法具有最高的重复性（单元内%CV分别为3.5%和4.8%），而基于ZIM的方法尽管灵敏度更高，但变异性更大。ZIM与DLS的结合为深入了解难溶性药物的沉淀起始及过饱和行为提供了更全面的认识，有助于在早期制剂开发中改进表征和动力学溶解度评价。

研究背景方面，近年来提高溶解度并保持足够膜通透性以改善口服生物利用度的策略受到大量关注，过饱和策略因可在不改变化合物固有热力学溶解度或通透性的前提下提高药物浓度而日益受到重视。过饱和可通过溶剂转换、无定形固体分散体（ASD）、成盐、pH转换、自乳化给药系统（SEDDS）及脂质系统等多种制剂策略实现，也可在体内胃肠道转运过程中自然发生。文献中描述溶解度、过饱和及相关现象的术语高度多样，导致这些概念的定义和解释存在差异。过饱和上限常被称为动力学溶解度或表观无定形溶解度，定义为首次可检测相分离或沉淀发生时的浓度，严格而言只有在适当固态表征确认沉淀固相为无定形时才能称为无定形溶解度。与在平衡条件下需数小时甚至数天测定的热力学溶解度不同，动力学溶解度测定时间尺度显著更短，通常为数分钟至多几小时，这一较短的非常平衡测定窗口可能更贴近胃肠道转运条件，并可能成为生物药剂学模型与模拟的合适输入参数。高于该浓度时可能发生液-液相分离（LLPS），形成药物富集分散相，可在结晶前暂时维持过饱和，LLPS为亚稳态，最终伴随结晶，尽管其是沉淀前的常见中间态，但实验检测尤其是直接目视观察极具挑战。测定动力学溶解度最常用的实验方法之一是助溶剂淬灭（溶剂转换）法，即将原料药（API）先溶于水混溶性有机溶剂（早期药物开发中多为DMSO），再缓慢加入水性介质，稀释时产生过饱和。现有问题在于，传统分离固体后经直接紫外或HPLC-UV测定上清液浓度的方法因孵育和过滤步骤往往得到已沉淀样品，其溶液浓度远低于过饱和上限；直接测定过饱和上限需在沉淀起始时原位测量溶液浓度而无需固液分离，导数光谱常用于校正悬浮颗粒散射引起的吸收光谱干扰，散射通常导致光谱基线随波长缓慢抬升且与波长的负幂次成正比，由于散射所致吸收曲线斜率变化缓慢，其光谱二阶导数在几乎任何波长处相对化合物吸收光谱的二阶导数均可忽略，但存在纳米颗粒时该法仍有局限。检测已知溶液浓度下的固体颗粒或新液相通常通过监测浊度或非吸收波长的紫外消光实现，基线信号升高归因于颗粒或液滴形成所致光散射。此外，零截距法（ZIM）利用特定化合物二阶导数光谱在特定波长（称为ZIM点，λ_ZIM）穿越波长轴、且这些点不依赖化合物浓度的特点，当浓度超过过饱和上限形成新纳米相时，二阶导数值预期偏离零，因为纳米颗粒的紫外光谱不同于分子溶解态化合物，其不仅散射紫外光还表现可测吸收，从而在溶解态之外引入额外光谱成分。Konstantin Tsinman及其同事在ZIM开发方面具有开创性贡献，在针对萘普生和灰黄霉素的独立参考测定（如平衡透析）初步验证后，该方法成功扩展至其他难溶性药物；2018年Tsinman及同事进一步将ZIM与光谱重建和多组分回归相结合，实现同一紫外光谱中溶解药物与纳米颗粒组分的同步定量。为补充紫外技术，动态光散射（DLS）可作为检测分散相形成的平行方法，现有文献以多分散性指数（PDI）为指标，DLS基于布朗运动提供粒径与分布信息，可检测紫外测定中可能不明显的纳米尺度物质。研究目的是主要利用原位紫外光谱法测定药物动力学溶解度，并以光谱二阶导数分析、基线抬升评估和ZIM等不同方法评价数据，同时相互比较这些方法，并利用DLS考察其对动力学溶解度测定的检测能力。据研究人员所知，这是首个在8种模型API上系统比较多种基于原位紫外的动力学溶解度评价方法、并同时将这些测定与基于DLS的纳米颗粒检测相关联，从而评估其对过饱和与沉淀过程中不同物理化学转变灵敏度的研究。

关键技术方法方面，动力学溶解度采用配备原位紫外探针和AuPRO? 7.1软件的μDISS? profiler（Pion Inc.）以溶剂转换法测定，所有结果因沉淀固相未经表征而统称动力学溶解度；储备液多以甲醇配制，匹莫苯丹、替米沙坦分别用DMSO和1 M NaOH配制，100 nm标准聚苯乙烯纳米珠为水溶液，有机溶剂加入量始终低于2%且多数低于1%；各API在其中性形式pH下测定，两性化合物在其等电点测定，采用Britton-Robinson缓冲液（BRB，含0.04 M乙酸、0.04 M磷酸、0.04 M硼酸）以0.2 M NaOH调至2.0–10.0的目标pH，为排除缓冲液组分干扰还在超纯水（两性化合物用磷酸缓冲液）中测定；10 mL相应缓冲液于37°C、200 rpm搅拌，储备液以0.5–40 μL等分加入，每次加入后由原位紫外探针追踪光谱变化以检测沉淀，测定盐类时加入计算量0.1 M NaOH或0.1 M HCl维持pH，替米沙坦在各介质中加1 M HCl以抵消碱性储备液影响；测定后核查悬浮液pH，进行3–6次平行实验，探针尖端尺寸为2、5、10或20 mm；二阶导数由AuPRO? 7.1软件计算并采用5点（10 nm）移动平均算法，紫外评价分别采用基线抬升法（逐化合物确定非吸收基线波长）、二阶导数法（在选定波长范围内计算二阶导数曲线下面积AU并构建AU–浓度校准曲线）和ZIM法（软件自动寻找标准品二阶导数光谱穿越波长轴的ZIM点并在λ_ZIM处计算AU值）；DLS采用Malvern Zetasizer Pro（Malvern Panalytical，英国）于37°C、背散射模式（173°）、一次性聚苯乙烯比色皿中监测纳米颗粒形成，样品测量前平衡120秒，以首次可可靠确定峰最大值的浓度作为颗粒形成的DLS检测限并作为主要DLS终点；统计分析采用可交换性分析，仅保留阳性响应并在log₁₀尺度分析，预先设定原始尺度±15%等效界值（对应对数尺度±log₁₀(1.15)），采用线性混合效应模型、90%置信区间偏倚评估及95% Bland–Altman预测限判定方法对是否可互换。

研究结果方面，3.1 卡马西平（pH 10）动力学溶解度的紫外光谱测定：紫外光谱测定以基线抬升、二阶导数光谱和ZIM三种方法评价，基线抬升采用非吸收波长（卡马西平为360 nm），低浓度时溶液澄清且该波长吸光度近零，颗粒出现后光散射增强该波长吸光度，浓度轴截距定义基线抬升法的相分离浓度；二阶导数法选择化合物有吸收的波长范围（卡马西平为310–325 nm）并计算二阶导数光谱下面积，其与浓度成正比直至相分离发生，由初始线性相与第二（通常非线性）相的截距定义二阶导数法的动力学溶解度；ZIM法选取单一或多个ZIM点（卡马西平λ_ZIM = 304.5 nm），滴定过程中检测λ_ZIM处AU值，实验初期该值约为0 nm，相分离发生后紫外光谱畸变致AU值升高，该升高在一定浓度范围内呈线性，随后出现第二个明显拐点（ZIM2），表现为导数信号在初始ZIM升高后下降或增速减慢，通过对曲线两段线性部分拟合直线并以交点对应浓度确定ZIM2。为更好理解光散射颗粒对三种紫外方法的影响，向100 μg/mL卡马西平澄清液（该浓度远低于三种方法检出的沉淀浓度）中加入含100 nm标准聚苯乙烯纳米珠的悬浮液：基线抬升法中纳米颗粒浓度增加导致基线信号升高；二阶导数分析中信号随API浓度成比例增加，纳米颗粒加入除轻微波动外未引起明显AU值变化，表明二阶导数分析有效补偿光散射所致AU值升高；ZIM分析中纳米颗粒浓度增加仅使ZIM点AU值轻微升高，远小于卡马西平沉淀存在时的升高，提示在相对较低颗粒浓度下ZIM对紫外吸收变化比对非吸收颗粒所致光散射更敏感，一种可能解释是纳米尺度颗粒存在于溶液中并贡献其自身吸收光谱，该光谱类似分子溶解态药物但存在轻微光谱畸变，这些光谱形状差异可能在理论上溶解药物贡献为零的ZIM点产生非零二阶导数信号，因而该波长处实测AU值主要可归因于新相而非溶解药物的光谱贡献。3.2 卡马西平（pH 10）相分离测定的动态光散射：DLS实验中评估峰最大值、Z平均粒径和平均计数率及PDI，无颗粒溶液中PDI和Z平均粒径无物理意义，因仪器未检测到颗粒但拟合算法仍基于背景噪声返回数值，故各图首批非信息性测量点以空心标记标示；Z平均粒径初始较高但随卡马西平浓度增加显著下降，最低值约在330 μg/mL，而峰最大值在几乎整个浓度范围内接近0 nm，仅在约330 μg/mL处观察到单一显著峰，同时平均导出计数率大幅升高，400 μg/mL以上样品过于浑浊无法测定；结果表明PDI和Z平均粒径值不易解释，而首次可定量峰最大值出现及平均导出计数率显著增强的浓度更直观，故本研究将DLS测定的动力学溶解度定义为该峰最大值出现且导出平均计数率升高的浓度。为进一步理解光散射颗粒对平均导出计数率和DLS检测阈值的影响，向100 μg/mL卡马西平澄清液（与3.1节紫外实验相同装置）中加入标准100 nm聚苯乙烯纳米珠悬浮液，结果在低颗粒浓度下散射信号无法基于平均导出计数率与背景可靠区分，但高于100 kcps时平均导出计数率与聚苯乙烯浓度成比例增加，低于该范围时平均导出计数率与背景信号相当，尤其在约50 kcps处无法获得可靠测量，进一步稀释聚苯乙烯未改变观察结果。3.3 卡马西平紫外光谱与DLS结果的比较：现有文献提示滴定过程中PDI值变化与紫外光谱测定的基线抬升相关，故本节讨论PDI与ZIM、二阶导数和基线抬升的相关性；PDI升高起始（200–300 μg/mL）反映随沉淀进展形成高多分散体系，与λ_ZIM处AU值升高一致，而二阶导数和基线抬升法在更高浓度给出结果，此时溶液因固体颗粒过于浑浊以致DLS无法测得PDI，这些比较在所有研究化合物上进行并观察到相似趋势。将PDI与紫外光谱数据关联可显示一定相似趋势，但须非常谨慎，因为初始高PDI值源自累积量分析，代表对测量噪声的拟合而非有物理意义的颗粒群，而目视沉淀发生后PDI可能再次对进一步变化不敏感。因此DLS测定中将平均导出计数率与PDI和峰最大值一并评价，并将平均导出计数率的浓度依赖性变化与相应ZIM结果比较，发现ZIM信号–浓度曲线与导出计数率–浓度曲线的趋势高度一致，进一步支持DLS导出计数率变化与ZIM信号之间的强相关性，表明两种分析方法在检测颗粒形成起始方面的一致性。将平均导出计数率的浓度依赖性趋势与二阶导数和基线抬升法比较，结果显示DLS检测对沉淀早期起始比二阶导数或基线抬升法更敏感；据此，以峰最大值首次出现的浓度结合导出平均计数率来定义DLS测定的动力学溶解度更为有利；结果还表明ZIM对初始纳米尺度颗粒形成尤为敏感，早于引起可检测基线抬升和二阶导数信号变化的较大聚集体。3.4 所有化合物的紫外光谱与DLS结果：为排除缓冲液组分干扰，在超纯水和缓冲液中均进行光谱测定，所有化合物结果一致，表明溶出介质对动力学溶解度的光谱测定无显著影响，故每种化合物仅展示一种代表性介质，尼氟酸和替米沙坦在磷酸缓冲液中测定，其余化合物在超纯水中测定。亮点包括：萘普生以ZIM1测定的动力学溶解度与既往发表值（18–21 μg/mL）高度一致，该值系用相同ZIM方法获得，为当前实验方法提供额外信心，且结果与独立平衡透析测定、扫描电子显微镜（SEM）及显示纳米级颗粒的DLS结果一致；卡维地洛和匹莫苯丹中观察到以油滴形式的目视相分离，提示LLPS形成，该观察与ZIM结果一致，而更大浑浊颗粒在测定后期基线抬升和二阶导数检测到变化时出现，匹莫苯丹用DMSO储备液测定，但因有机相与水性介质溶解度差异大，最终DMSO浓度保持在0.05%以下；相反司来吉兰显示即时可见沉淀而无 detectable 纳米尺度中间态，该化合物高溶解度和强吸收可能导致测定末期部分检测器饱和，难以在可接受吸光度范围内确定可靠ZIM点，此外ZIM、二阶导数和基线结果彼此非常接近，第二ZIM交点位置偏高，可能受高吸光度值影响，与二阶导数曲线或基线位移结果均不吻合。DLS测量中亦有关键观察：开始时未检测到颗粒，加入首批储备液等分后颗粒仍处纳米范围（0–65 nm），萘普生例外，显示一个较大的峰最大值于120，PDI降至约0.2–0.4后出现较大颗粒（>100 nm），萘普生和司来吉兰的粒径分别超过200和300。在所有研究化合物中，二阶导数和基线抬升法给出可比的动力学溶解度值，通常彼此相差在10%以内；而ZIM方法比基线抬升和二阶导数方法更早检测到沉淀起始，平均约为相应基线/二阶导数浓度的60%（各化合物范围约41%–92%）；即使仅目视观察亦可见ZIM1始终在较低浓度检测到相分离，其结果与DLS结果高度一致，各化合物DLS与ZIM浓度比约为0.95至1.25，这些结论得到统计分析进一步支持。对不同紫外数据解释方法的比较性统计评价显示在一致性和精密度上存在明显差异：方法特异性重复性分析表明二阶导数法单元内%CV最低（约3.5%），其次为基线法（约4.8%），重复性良好；基于ZIM的方法变异性更大且存在系统性偏差，主要ZIM终点单元内%CV最高（约6.6%）；包含ZIM的任何成对比较均未落入±15%等效界值内，表明首个ZIM终点对应不同的相形成现象；第二ZIM交点（ZIM2）更接近二阶导数和基线抬升法所识别的光学可检测颗粒形成阶段，尽管ZIM2并非既定的动力学溶解度终点，但研究发现以此法确定的浓度与二阶导数或基线抬升分析所得浓度高度一致。二阶导数与基线抬升法之间的一致吻合表明两种方法检测相似的物理化学事件，最可能是形成足以引起可测光散射的光学可检测颗粒；除颗粒尺寸外，颗粒数量（或浓度）及颗粒与周围介质折射率差异也影响光散射，这得到其最小平均偏倚（约10%）和所有方法对中最窄一致性界限的支持，近89%观察值落入预先设定的±15%等效界值内，表明这些方法可提供准确且一致的动力学溶解度估计。相反ZIM始终在较低浓度检测到转变，并与DLS检测的颗粒形成起始最为吻合，表明其对先于可见浊度或基线抬升的早期纳米尺度聚集事件敏感，提示ZIM可在较大聚集体出现前检测少量纳米尺度颗粒形成，因此在λ_ZIM处监测二阶导数信号为识别动力学溶解度测定中颗粒形成起始提供了灵敏方法，这与ZIM监测特征零交叉波长处导数信号细微变化、可响应早期相分离的原理一致；支持该解释的是ZIM所得结果与DLS测量良好相关，后者在接近ZIM终点的纳米尺度范围（1–100 nm）检测到颗粒。ZIM与DLS测量之间观察到的相关性提示细微光谱位移可作为纳米尺度相分离早期阶段的间接指标，甚至在常规光学变化显现之前，该观察可能为过饱和药物体系的行为与表征及这些制剂的沉淀提供有价值见解。

讨论与结论方面，作者指出该研究的重要发现是DLS与紫外方法因依赖不同光学原理而对颗粒形成提供互补信息：DLS和基线抬升均反映颗粒存在所致光散射，而二阶导数分析评价紫外吸收光谱曲率变化，减少与散射相关的渐进基线抬升影响，ZIM亦主要依赖紫外光谱中与吸收相关的变化，聚焦于对紫外吸收光谱任何形状变化检测最灵敏的波长；因此这些方法间的一致性并非不言自明，因为它们捕获同一过程的不同方面，ZIM与DLS之间的一致性尤其值得注意，表明主要经吸收光谱分析检测到的变化对应由光散射独立检测到的颗粒形成；同样，基线抬升与二阶导数分析之间的一致性也非必然预期，因前者反映颗粒诱导散射而后者通过溶解药物浓度降低间接检测沉淀。这些发现表明动力学溶解度值具有方法依赖性，不同分析方法可能检测过饱和、相分离和颗粒形成的不同阶段；二阶导数和基线抬升提供稳健而精确的测量，ZIM则在萘普生等情况下对早期（甚至纳米尺度）聚集提供互补灵敏度并与DLS测量良好一致；ZIM虽对体系细微变化更敏感，但准确性取决于使用无颗粒溶液获得的参考光谱。最终，理解不同分析方法如何捕获相分离的不同阶段对于将体外溶解度测量转化为体内药物性能的可靠预测至关重要；未来研究应将这些考察扩展至含胆盐、磷脂和动态pH条件的更具生理相关性的介质，同时扩大研究化合物集以纳入具有不同结晶倾向和物理化学性质的其他API。研究结论译文为：在化合物呈中性的pH值下，于不同介质中测定了8种化合物的动力学溶解度，利用同一紫外光谱比较了三种不同评价方法（基线抬升、二阶导数、ZIM），并辅以平行DLS测量。ZIM与DLS测量显示出良好一致性，支持识别若干难溶性药物分子的沉淀起始。值得注意的是，ZIM图的第二交点（ZIM2）与二阶导数和基线抬升方法显示良好一致性，提示其对应光学可检测的颗粒形成而非早期（萘普生情况下为纳米尺度）聚集。本研究的一个重要发现是DLS与基于紫外的方法因依赖不同光学原理而对颗粒形成提供互补信息：DLS和基线抬升均反映颗粒存在所致光散射，而二阶导数分析评价紫外吸收光谱曲率变化，减少与散射相关的渐进基线抬升影响；ZIM亦主要依赖紫外光谱中与吸收相关的变化，聚焦于对紫外吸收光谱任何形状变化检测最灵敏的波长。因此这些方法间的一致性并非自明，因为它们捕获同一过程的不同方面；ZIM与DLS之间的一致性尤其值得注意，表明主要经吸收光谱分析检测到的变化对应由光散射独立检测到的颗粒形成；同样，基线抬升与二阶导数分析之间的一致性也非必然预期，因前者反映颗粒诱导散射而后者通过溶解药物浓度降低间接检测沉淀。这些发现表明动力学溶解度值具有方法依赖性，不同分析方法可能检测过饱和、相分离和颗粒形成的不同阶段；二阶导数和基线抬升提供稳健而精确的测量，ZIM则在萘普生等情况下对早期（甚至纳米尺度）聚集提供互补灵敏度并与DLS测量良好一致；ZIM虽对体系细微变化更敏感，但准确性取决于使用无颗粒溶液获得的参考光谱。最终，理解不同分析方法如何捕获相分离的不同阶段对于将体外溶解度测量转化为体内药物性能的可靠预测至关重要；未来研究应将这些考察扩展至含胆盐、磷脂和动态pH条件的更具生理相关性的介质，同时扩大研究化合物集以纳入具有不同结晶倾向和物理化学性质的其他API。