《North American Journal of Aquaculture》：Dietary inclusion of tuna liquid hydrolysate: Effects on the Pacific white shrimp Penaeus vannamei performance and gut health
编辑推荐：
## 摘要
目的：凡纳滨对虾（*Penaeus vannamei*）在美洲具有重大意义，并构成墨西哥的主要水产养殖活动。诸如鱼类副产物等新型饲料添加剂可提高生产盈利能力并支持对虾健康与生产性能。本研究旨在探究金枪鱼液体水解物（tuna liquid hydr
## 摘要
目的：凡纳滨对虾（*Penaeus vannamei*）在美洲具有重大意义，并构成墨西哥的主要水产养殖活动。诸如鱼类副产物等新型饲料添加剂可提高生产盈利能力并支持对虾健康与生产性能。本研究旨在探究金枪鱼液体水解物（tuna liquid hydrolysate，TLH）对在半咸水条件下集约化商业系统中养殖的凡纳滨对虾生产性能的影响，分析相关的投资回报（return on investment），并考察TLH诱导的肠道菌群（gut microbiota）调节作用。方法：研究人员考察了两种TLH日粮添加水平（2.0%[TLH 2.0]与4.0%[TLH 4.0]）对在半咸水集约化条件下养殖6周的凡纳滨对虾幼虾生产性能及肠道微生物调节的影响。结果：TLH 2.0组较TLH 4.0组表现出更高的终末生物量（final biomass）、更低的饲料转化率（feed conversion ratio，FCR）及更高的终末产量（final yield）。此外，TLH 2.0组的投资回报率高于对照组和TLH 4.0组。成活率、终末平均体重、增重及特定生长率（specific growth rate，SGR）未受TLH日粮添加的影响。TLH维持了微生物稳态（microbial homeostasis）。变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、候选门OD1（Parcubacteria）及梭杆菌门（Fusobacteria）在所有实验组中均占优势。乳球菌属（*Lactococcus*）、鲸杆菌属（*Cetobacterium*）、微小杆菌属（*Exiguobacterium*）、肠球菌属（*Enterococcus*）及分枝杆菌属（*Mycoplana*）为所有实验组中丰度最高的属。沉积杆菌属（*Sediminibacterium*）在两个TLH日粮处理组中均下降。益生菌属芽孢杆菌属（*Bacillus*）受TLH 2.0日粮刺激而增加。肠球菌属（*Enterococcus*）、乳球菌属（*Lactococcus*）、鲸杆菌属（*Cetobacterium*）及希瓦氏菌属（*Shewanella*）以及根瘤菌目（Rhizobiales）构成本研究中凡纳滨对虾核心菌群（core microbiota）的组成部分。结论：本研究提示TLH可作为凡纳滨对虾幼虾的功能性水产饲料（functional aquafeed）添加，推荐日粮添加水平为2.0%；其可支持最佳生长与成活、维持肠道健康，并带来更优的投资回报。
## 论文主体解读
### 一、研究背景与立项依据
凡纳滨对虾（*Penaeus vannamei*）是全球对虾养殖的主导物种，2020年全球产量达580万公吨，主要生产国分布于亚洲（中国、印度及东南亚）与美洲（美国、墨西哥、中美洲及热带南美）。该物种是墨西哥农业部门的主要水产养殖产品，尤以超集约化养殖（super-intensive shrimp farming）展现出高盈利性。研究人员指出，凡纳滨对虾为强壮的广盐性（euryhaline）十足目动物；在墨西哥，低盐度养殖的对虾因肉色较深、烹煮后体色偏红，其市场价值较海水养殖对虾高约10%。然而，饲料成本是养殖场支出中最昂贵的投入项；同时，全球工业渔业弃获量估计每年约1000万公吨，金枪鱼（*Thunnus* spp.、鲣鱼*Katsuwonus pelamis*）罐头加工过程中高达52%–54%的鱼体总重作为废弃物被丢弃。上述问题推动了循环经济（circular economy）理念下水产养殖业的可持续发展诉求，即鼓励利用替代性天然饲料来源、实现渔业副产物的再利用。由金枪鱼内脏及其他废弃物制得的TLH因价格低廉、组成与供应相对稳定而被视为有前景的水产饲料添加剂，其提供饲料诱食性与质构特性，并是抗氧化肽的潜在来源；本研究所用TLH含14%–16%粗蛋白（>90%可溶）、12.6%总氨基酸，80%组分为<500道尔顿的低分子量肽，并含21%ω-3脂肪酸（15%二十二碳六烯酸与4%二十碳五烯酸）。鱼蛋白水解物来源的生物活性肽已被证实具有抗氧化、抗菌及免疫调节特性；新近研究亦显示金枪鱼水解物可改善凡纳滨对虾生产性能、摄食量、蛋白质消化率、肠道形态及抗副溶血性弧菌（*Vibrio parahaemolyticus*）感染能力。基于此，研究人员开展本研究，目的为：（1）研究TLH对半咸水条件下集约化商业系统中养殖的凡纳滨对虾生产性能（生长参数、成活率及饲料接受度）的影响；（2）分析TLH作为水产饲料添加剂时的投资回报；（3）考察该条件下TLH对虾肠道微生物的调节作用。
### 二、主要研究方法
研究人员在墨西哥科利马州特科曼的商业对虾养殖场（Granja Acuícola Los Tucanes）开展场内投喂试验：1500尾凡纳滨对虾先行在育苗池（100 m3）暂养22天，随后将幼虾（初始体重4.53 ± 0.02 g）随机分配至15个锚定浮动网箱（每箱100尾，密度65尾/m3，同一池塘0.5 ha、深2.5 m），进行为期6周的投喂试验；设对照组、TLH 2.0与TLH 4.0三个日粮处理，每处理5个网箱。试验日粮等蛋白、等能量（粗蛋白25.8%，蛋白消化率86%），TLH（黄鳍金枪鱼*Thunnus albacares*内脏来源，Symrise Aqua Feed）添加于基础商品虾料之上。关键技术方法包括：常规生长性能与经济指标（终末产量、投资回报）计算；试验末期每组随机取6尾虾（共18尾）以热休克法处死，无菌采集全肠及内容物，于70%（v/v）分子级乙醇中固定并?20℃保存；肠道样本DNA提取后，扩增原核16S核糖体RNA基因V1–V2区（引物27F与338R-I/338R-II，片段约350 bp），采用Ion Torrent个人基因组测序仪（Thermo Fisher Scientific）进行高通量测序；原始序列经FASTX-Toolkit质控、QIIME 1.8.0分析，以97%序列一致性聚类操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs），Ribosomal Database Project工具以0.8置信水平确定分类归属；通过Chao1、观测物种数及系统发育多样性等α多样性指数、加权与非加权UniFrac距离的主坐标分析、LEfSe（线性判别分析效应量）及Venn图鉴定核心菌群。原始序列数据已存于NCBI序列读取档案（BioProject ID PRJNA716672）。
### 三、研究结果
**动物生产性能**：三组间成活率、增重及特定生长率无显著差异，各组成活率均>84%。TLH 4.0组终末生物量与终末产量显著低于TLH 2.0组，饲料转化率显著高于TLH 2.0组；TLH组与对照组间无差异。虽未达显著，TLH 2.0与TLH 4.0增重较对照组分别提高8.9%与5.0%，具商业意义。经济分析显示，TLH 2.0组终末产量显著高于TLH 4.0组，较对照组提高10.1%（差异不显著）；TLH 2.0组效益成本比最高，投资回报率较无TLH日粮提高60.6%（p = 0.007）。
**高通量测序结果**：共获5,277,002条原始读数，质控后平均104,582条高质量读数（81,928–133,308）；古菌域被过滤。全部样本Good's覆盖度指数>0.995，稀释曲线达饱和平台。α多样性指数显示三组间细菌群落丰富度与多样性无显著差异。
**肠道微生物组的相对丰度与多样性**：共鉴定9个相对丰度>1%的细菌门。变形菌门丰度最高，其次为厚壁菌门，二者在各组间丰度相近；拟杆菌门为第三优势门，在TLH 4.0组较对照组下降；Parcubacteria与梭杆菌门分列第四、第五，组间无显著差异。属水平上，肠球菌属与鲸杆菌属丰度最高，其次为乳球菌属、候选门OD1（Parcubacteria）及微小杆菌属；TLH日粮添加导致沉积杆菌属（*Sediminibacterium*）下降，其余属相对丰度差异不显著。
**肠道菌群谱比较**：基于加权与非加权UniFrac距离的主坐标分析显示样本群落混合分布，处理间无明显分离；加权分析中多数样本趋于聚集，非加权分析则显示细菌群落更为分散。LEfSe分析显示TLH 2.0与TLH 4.0组各含两个差异分类群（TLH 2.0组富集*Herbaspirillum*属与Pseudomonadaceae科；TLH 4.0组富集Erythrobacteraceae科与*Dyadobacter*属）；对照组含8个差异富集分类群，以Lactobacillaceae科效应量最大（LDA评分>7.0），另包括Alteromonadales目、*Shewanella*属及Vibrionales目。
**核心菌群**：属水平Venn图显示核心菌群由74个共享OTUs组成，即48.4%的OTUs不受任何日粮处理影响；共享OTUs包括*Enterococcus*、*Exiguobacterium*、*Lactococcus*、*Cetobacterium*、Rhizobiales及*Shewanella*等。TLH 2.0组含10个独有OTUs（6.5%），包括重要益生菌属*Bacillus*；其与对照组共享6个OTUs（3.9%），与TLH 4.0组共享13个OTUs（8.5%）。TLH 4.0组含23个独有OTUs（15%），包括*Pseudomonas*与*Nitrobacter*，与对照组共享14个OTUs（9.2%），且独有细菌OTUs数量最多。30%的OTUs受TLH添加影响：46个属水平OTUs仅见于TLH处理组；对照组含13个独有OTUs，提示8.5%的肠道菌群在摄食TLH日粮的虾中被抑制。
### 四、讨论与结论
讨论部分指出：就成活率而言，各组均维持高于集约化养殖商业标准的优异水平；TLH虽未带来明显的生长或成活改善，但支持最佳养殖性能与成活，TLH 2.0处理对半咸水幼虾最具吸引力且无负面影响，故TLH可用于对虾营养而不产生不良后果；作者建议进一步开展免疫参数、试验饲料氨基酸谱及营养基因组学分析以印证营养利用效果。关于饲料转化率，本研究报告的表观FCR偏高，可能源于基于摄食量的高投喂率导致的饲料浪费；试验日粮粗蛋白较低（25.8%，经济型配方）及网箱养殖系统使虾无法获取底栖天然饵料与碎屑，亦可能造成FCR高于典型池塘条件；未来研究应严格遵循投喂表指标。作者亦指出未开展水中稳定性、营养浸出与干物质保持试验，故不能完全排除TLH 4.0日粮中颗粒稳定性或营养浸出的贡献，但该添加水平下性能较低亦可能涉及黏稠、富脂TLH产品本身更高添加量相关的其他因素，该假设有待进一步研究。经济方面，TLH可使生产率提高至多10%并提升投资回报，尤以TLH 2.0水平为著，这在因供应大于需求致虾价下跌、预计利润收缩的背景下尤为重要，故作者支持在集约化半咸水对虾养殖饲料中添加TLH 2.0。肠道菌群方面，α与β多样性指数表明TLH添加未改变细菌物种丰富度或多样性，微生物群落组间相似，提示TLH支持肠道稳态而不引起菌群失调（dysbiosis）；由于水体盐度影响凡纳滨对虾肠道菌群，上述结果应主要在半咸水系统情境下理解。作者进一步讨论了变形菌门为虾肠道中最稳定的门；拟杆菌门在TLH 4.0组下降及其糖酵解基因降解日粮碳水化合物（如非淀粉多糖与寡糖）的作用；*Sediminibacterium*的低丰度及其以碳水化合物为碳源、生物活性肽增加可能降低其相对丰度；*Enterococcus*与*Cetobacterium*为最优势菌属，前者为具益生效果的重要乳酸菌并增强甲壳动物抗*Vibrio harveyi*与*V. parahaemolyticus*能力，后者与鱼类维生素B12（钴胺素）产生内在相关且其丰度可能与养殖密度相关；*Lactococcus*、候选门OD1（Parcubacteria）及*Exiguobacterium*的高丰度及其对虾生长、免疫、抗病与消化酶活性的有益作用，其中本研究为首次在凡纳滨对虾肠道菌群中报道候选门OD1（Parcubacteria）读数。Venn图显示核心菌群占48.5% OTUs，说明核心细菌群落未受TLH高度调节，但TLH影响了菌群组成：Lactobacillaceae科、*Corynebacterium*及Flavobacteriales受TLH处理抑制；TLH 2.0组为唯一呈现*Bacillus*的处理组，该属具益生效果及多种改善动物消化与饲料吸收的消化酶；*Pseudomonas*与*Nitrobacter*读数仅见于TLH 4.0组。LEfSe分析表明TLH添加对差异分类群组成具显著影响。
**结论译文**：日粮添加TLH，尤其是2.0%水平，支持在半咸水中养殖的凡纳滨对虾幼虾获得充分的增重与生长，并维持优异成活率。金枪鱼液体水解物可作为功能性水产饲料添加剂使用，不对虾的生长与成活产生任何负面影响，从而支持对虾生产性能。2.0%添加水平的TLH具经济吸引力，可使生产率提高10%并带来更优投资回报，同时最大化金枪鱼副产物的市场价值。TLH维持对虾肠道微生物组成，不改变细菌丰富度或多样性，促进稳定的微生物组成；尤其在2.0%添加水平下，TLH刺激*Bacillus*等益生菌的存在。另一方面，高添加水平（即4.0%）的TLH可能不利，导致终末生物量与终末产量降低并损害最优投资回报。总之，TLH是一种可持续的日粮添加剂，在商业条件下养殖周期内维持对虾生产性能并促进肠道健康；因此，本研究支持将TLH作为半咸水凡纳滨对虾养殖的饲料添加剂使用，尤以2.0%添加水平为宜。最后，鉴于TLH 2.0呈现最具吸引力的结果，作者建议进一步比较1.0%与1.5%相对于2.0%的日粮添加水平，以确定对最终消费者具更佳成本效益的精确TLH添加水平。
