《Food Chemistry: X》：Metabolic profiling and machine learning-based identification of key metabolites in 232 Huangjincha accessions
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对232份黄金茶（HJC）种质及13份对照茶树品种的35种主要非挥发性代谢物（包括儿茶素、生物碱、酚酸和氨基酸）进行定量分析，并采用10种机器学习模型进行二分类建模，以区分黄金茶与对照品种。氨基酸类代谢物表现出较低的变异系数（CV）；没食子儿茶素（GC）、儿茶
对232份黄金茶（HJC）种质及13份对照茶树品种的35种主要非挥发性代谢物（包括儿茶素、生物碱、酚酸和氨基酸）进行定量分析，并采用10种机器学习模型进行二分类建模，以区分黄金茶与对照品种。氨基酸类代谢物表现出较低的变异系数（CV）；没食子儿茶素（GC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、亮氨酸、茶碱和苦茶碱表现出高度变异性；随机森林（RF）模型在区分黄金茶代谢物方面表现最佳；蛋氨酸、酪氨酸和脯氨酸可作为该群体的潜在生物标志物。
一、研究背景
茶树（Camellia sinensis）在长期自然与人工选择下形成了稳定性状并保持遗传多样性。中国拥有丰富的茶树种质资源，包括野生近缘种、地方品种和栽培群体。‘保靖黄金茶’［Camellia sinensis (L.) O. Kuntze ‘Baojing Huangjincha’］群体主要在湖南省保靖县以种子繁殖，以发芽早、氨基酸含量高、滋味鲜爽著称。该群体已登记6个国家级品种（如‘保靖黄金茶1号’），另有14个品种获得植物新品种保护；自2010年以来，HJC系列品种在湖南及周边省份推广，种植面积超过6万hm2，年产值达数十亿元。
氨基酸是茶树中重要的含氮化合物，以游离态和结合态存在，参与生长、氮代谢及茶叶品质（尤其鲜味和甜味）形成。茶叶中已鉴定出20余种氨基酸，其中茶氨酸为茶树特有氨基酸，占总游离氨基酸的40%–60%。‘保靖黄金茶1号’春季总氨基酸含量峰值超过4%，高于典型绿茶（1%–2%）。苯丙氨酸和酪氨酸是多酚和生物碱生物合成的碳氮前体；苯丙氨酸经苯丙氨酸解氨酶（PAL）转化为肉桂酸，进而形成咖啡酸、没食子酸等酚类中间体，是类黄酮和儿茶素形成的关键。没食子酸作为酰基供体生成表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）等酯型儿茶素，是茶叶涩味的主要化学基础。没食子酸及其酯类经莽草酸途径产生，是茶酚酸的主要部分，影响滋味，增强醇厚感和回甘；没食子酸可与奎尼酸或葡萄糖形成酯（茶没食子素、β-葡萄糖没食子素），作为后续儿茶素没食子酰化的储存或活化形式。生物碱作为氮代谢产物也是苦味的主要贡献者，可可碱和茶碱是嘌呤生物碱生物合成的中间体，咖啡因为主要终产物和茶叶中最丰富的生物碱，可被氧化为1,3,7-三甲基尿酸，或在某些种质中转化为苦茶碱。这些酚酸、儿茶素和生物碱不仅贡献关键感官和生物活性特性，也为评价茶树种质代谢变异提供了候选生化指标。
随着代谢组学的发展，大规模代谢数据集日益可及，但具有高维、多变量特征，常呈复杂非线性关系，传统方法难以充分捕捉；机器学习方法可高效识别信息特征并建模复杂非线性模式，在模式识别、特征选择和分类预测中表现更优。因此，本研究聚焦232份HJC种质和13份对照茶树品种，基于已知的滋味和品质形成作用及标准品可获得性，选取35种主要非挥发性代谢物（包括儿茶素、生物碱、酚酸和氨基酸）作为靶向面板，应用多种二分类算法刻画群体水平代谢变异，以解析HJC种质变异的代谢基础，并结合机器学习鉴定区分HJC与对照品种的候选判别代谢物。
二、主要关键技术方法
研究人员于2024年3月下旬至4月中旬在湖南省长沙县高桥镇湖南省茶叶研究所实验基地（113°19′E，28°29′N）采集232份HJC种质资源及13份对照茶树品种的一芽二叶样品，液氮速冻后真空冷冻干燥并研磨成粉。采用高效液相色谱（HPLC）定量儿茶素和生物碱（280 nm检测），采用在线衍生化HPLC法（邻苯二甲醛OPA和氯甲酸芴甲酯FMOC衍生，338 nm和262 nm检测）测定氨基酸，茶氨酸按国家标准GB/T 23193–2017测定。基于35种代谢物定量数据构建代谢物矩阵，采用Python 3.13.5及scikit-learn构建10种机器学习模型（逻辑回归、随机梯度下降逻辑回归、K近邻、支持向量机、高斯朴素贝叶斯、二次判别分析、随机森林、极端随机树、梯度提升决策树、多层感知机），按分层抽样以80%/20%划分训练集和测试集（随机种子42），进行五折分层交叉验证、重复分层三折交叉验证（30次重复）、置换检验（1000次）及基尼重要性和置换重要性分析。统计分析采用SPSS 25进行单因素方差分析及Tukey's HSD检验，并利用Metware Cloud平台进行K-means聚类、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），Origin 2021进行可视化。
三、研究结果
（一）HJC种质群体及代谢物分析
HPLC共定量4大类35种代谢物。儿茶素为HJC群体主要成分，占总定量代谢物的52.83%，以EGCG最丰富，其次为ECG；生物碱占17.11%，主要贡献者为咖啡因和可可碱；酚酸和氨基酸分别占15.18%和14.88%，含量最高者分别为茶没食子素和茶氨酸。与对照相比，HJC群体总儿茶素和酚酸含量显著较低，氨基酸含量显著较高，生物碱无显著差异，表明HJC群体在儿茶素主导的化学背景下呈现氨基酸富集的品质优势。群体水平上，多数代谢物变异系数（CV）在20%–80%，而没食子儿茶素（GC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、亮氨酸、茶碱和苦茶碱的CV超过100%；氨基酸中茶氨酸含量最高且变异较低，其他游离氨基酸个体变异大且分布偏斜；多数代谢物偏度和峰度显著偏离正态。按类别看，儿茶素变异大（CV=17%–167%，SI-norm=0.03–0.12），为代谢分化和品质变异的主要来源，其中EGCG相对稳定而CG和GC一致性较差；氨基酸最稳定（CV=14%–47%，SI-norm=0.02–0.05），可能作为HJC代谢稳态的潜在核心指标。小提琴图显示EGCG分布范围最广（37.87–135.33 mg/g），咖啡因为优势嘌呤生物碱，茶氨酸含量最高且分布较宽（11.17–33.39 mg/g），茶没食子素平均丰度仅次于EGCG且群体变异大（0.17–68.56 mg/g）。基于标准化数据的K-means聚类将232份HJC种质分为5个亚类，各亚类在4大类代谢物总体趋势及具体代谢物累积模式上均存在差异，非酯型儿茶素（C、EC、GC、EGC）在亚类5中较高，酯型儿茶素（CG、ECG、GCG、EGCG）在亚类4中富集，茶没食子素在亚类3中较高，多种氨基酸在亚类1、2和4中较高。
（二）基于HJC群体的差异代谢物分析
PCA结果显示前两个主成分解释总变异的38.47%，HJC与对照沿PC1良好分离。OPLS-DA模型有效区分两组，R2X=0.493、R2Y=0.743、Q2=0.667，R2Y和Q2均显著（p<0.05），但鉴于对照品种数量有限，其普适性需进一步验证。基于该模型鉴定出15种变量投影重要性（VIP）评分大于1的差异代谢物，其中仅1,2,6-三-O-没食子酰基-β-d-葡萄糖（7.14 mg/g）和EC（7.06 mg/g）在对照组中平均丰度较高，其余代谢物在HJC群体中更丰富。
（三）多种机器学习模型的构建
以35种代谢物为输入特征、样品类型为分类标签，构建包含数据预处理、分层训练/测试划分、多模型训练和交叉验证评估的机器学习流程，比较10种模型的预测性能和稳定性。结果显示各模型性能指标差异较大：随机森林和极端随机树在AUC、准确率、平衡准确率和F1分数上取得完美的交叉验证评分，高斯朴素贝叶斯在内部评估框架下也表现良好；梯度提升表现良好（平均AUC=1.000、F1=0.997、平衡准确率=0.950）；逻辑回归和多层感知机AUC和F1较高但平衡准确率较低；支持向量机（SVM）平均AUC为0.995，但平衡准确率仅0.500、特异性为0.000，对对照样品识别差；SGD-逻辑回归、K近邻和二次判别分析部分指标较低。基于分类性能、负类识别和模型稳定性，选取逻辑回归和SVM作为非树模型代表，随机森林、极端随机树和梯度提升作为最佳树模型代表进行后续特征重要性分析。1000次随机标签置换检验显示，10个模型观察到的最大交叉验证AUC为1.000，置换分布最大AUC的均值和95百分位分别为0.633和0.759，全局最大统计量置换检验P=0.000999，表明观察到的分类性能显著高于置换标签零分布下的预期。类别权重评估显示，类别加权未能在各算法间一致提高分类性能。
（四）基于树集成模型的分析
在化学类别水平上，氨基酸在三种树模型的基尼重要性、置换重要性和归一化置换重要性上均得分最高（归一化置换重要性超过2.5），表明其对模型贡献最稳定，凸显了HJC群体高氨基酸含量特征的意义；儿茶素和酚酸各项指标得分较低。在随机森林模型中，蛋氨酸基尼重要性最高，其次为酪氨酸和脯氨酸，茶氨酸得分最低；蛋氨酸置换重要性也最高。在极端随机树模型中，天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸重要性得分高，蛋氨酸和酪氨酸也较显著，置换重要性中天冬氨酸最高。在梯度提升模型中，仅蛋氨酸、1,3,7-三甲基尿酸和酪氨酸具有可观的基尼和置换重要性得分。综合三种模型和两种重要性指标，蛋氨酸为突出的候选判别代谢物，酪氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和1,3,7-三甲基尿酸也显示潜在判别价值，但重要性排序因模型和评价方法而异。基于90次模型拟合的稳定性分析显示，蛋氨酸、1,3,7-三甲基尿酸和酪氨酸在全部90次拟合中稳定位列前10，天冬氨酸、脯氨酸和赖氨酸分别有98.9%、98.9%和97.8%的拟合入选；但基尼重要性与置换重要性一致性有限，两种方法前10名平均共享1.40个特征，平均Jaccard指数为0.132，可计算的44次拟合中平均Spearman秩相关为0.349。
（五）基于随机森林模型的HJC群体关键代谢物鉴定
基于随机森林平均基尼重要性初步选取前10位候选判别代谢物，采用Mann–Whitney U检验比较HJC与对照组丰度，并进行ROC分析，以Youden指数确定最佳截断值。候选代谢物包括蛋氨酸、酪氨酸、脯氨酸、1,3,7-三甲基尿酸、天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸和茶氨酸，10种代谢物原始分析中个体AUC均大于0.98，蛋氨酸AUC达1.0，但因候选选择和判别评估使用同一数据集，这些AUC值应视为探索性估计。箱线图显示这些代谢物在HJC中丰度显著高于对照组（p<0.05）。蛋氨酸和酪氨酸在茶叶挥发性香气化合物生物合成中起重要作用，酪氨酸与苯丙氨酸互作促进花果香挥发物积累；脯氨酸在HJC种质中含量相对稳定，可通过调节氮有效性影响氨基酸含量和蛋白质合成，进而影响茶汤鲜爽度；1,3,7-三甲基尿酸是咖啡因生物合成的关键中间体，直接影响茶叶苦味和涩味；天冬氨酸、赖氨酸和谷氨酸参与茶树氮代谢和蛋白质合成，并作为与鲜味和细腻香气相关的关键氨基酸；茶氨酸为HJC中最丰富的氨基酸和茶树特有氨基酸，是重要氮源，既增强鲜爽度又降低苦味；丙氨酸和亮氨酸生理作用相似但判别力相对较低。这些结果提示氨基酸代谢可能贡献于HJC群体的代谢特征，所鉴定代谢物可作为当前数据集内区分HJC样品的候选生化指标。
四、讨论与结论
本研究在现有数据集内鉴定了区分HJC种质与对照品种的代谢特征，并建立了利用代谢物谱和机器学习表征HJC类代谢谱的初步框架；所鉴定代谢物为后续评价HJC相关代谢特征提供了候选生化标志物，但其对未知茶样品的适用性及在种质筛选或真实性鉴定中的潜在用途仍需独立验证确定。与单化合物判别相比，多代谢物方法提供更全面的生化指纹，可为后续品质评价和种质筛选提供依据。然而，对照组仅13个品种，而HJC种质达232份，尽管所有材料在相同栽培和田间管理条件下保存，但地理来源、遗传背景以及可能存在的株型、叶形态和发芽物候差异均可能导致观察到的代谢差异，因此这些差异不能完全归因于HJC身份，分类性能和候选代谢物应在当前数据集背景下解读。未来研究应纳入更大、更具代表性的对照群体、独立验证群体、跨年度采集样品和商业茶产品，以评估候选代谢物的稳健性和更广泛适用性，并将这些代谢物与感官评价及其他茶叶品质相关性状整合，以阐明其与特定品质属性的关系并评估其作为茶叶品质指标的潜力。
结论部分译文：本研究分析了232份黄金茶种质，整合了氨基酸、儿茶素、生物碱和酚酸的定量数据，并应用机器学习方法鉴定区分HJC种质与对照品种的候选代谢物。氨基酸在HJC组中普遍更丰富，而儿茶素在群体内表现出相当大的变异。在评估的分类模型中，随机森林在当前数据集内表现出较高的表观判别性能。基于特征重要性分析，鉴定出10种候选判别代谢物：蛋氨酸、酪氨酸、脯氨酸、1,3,7-三甲基尿酸、天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸和茶氨酸。蛋氨酸、酪氨酸和脯氨酸是区分HJC与对照样品的突出候选物，尽管重要性排序因模型和评价方法而异。这些发现提供了HJC代谢组的定量表征，并为进一步研究茶树育种中的代谢标志物提供了候选物质基础。未来研究应使用独立且具代表性的茶树种质群体验证这些候选代谢物，并将代谢物谱与感官评价及其他茶叶品质相关性状整合，以评估其作为茶叶品质指标的潜力并阐明其与特定品质属性的相关性。
