《Future Foods》：In silico-guided discovery and experimental validation of VPW from
Nannochloropsis oceanica as an antioxidant cytoprotective peptide and a protectant against H?O?-induced C3G degradation
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尽管微拟球藻（*Nannochloropsis oceanica*）被广泛用于饲料和油脂生产，但其蛋白质组分仍未得到充分利用。研究人员开发了一种虚拟-实验相结合的工作流程，以从微拟球藻蛋白酶解物中发现抗氧化肽。通过依次对356条肽段进行虚拟筛选，获得6个候选肽
尽管微拟球藻（*Nannochloropsis oceanica*）被广泛用于饲料和油脂生产，但其蛋白质组分仍未得到充分利用。研究人员开发了一种虚拟-实验相结合的工作流程，以从微拟球藻蛋白酶解物中发现抗氧化肽。通过依次对356条肽段进行虚拟筛选，获得6个候选肽，并将其与6个抗氧化相关核心靶点进行分子对接；其中，VPW表现出良好的结合能力，最佳结合能为?7.61 kcal/mol。超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱（UPLC–Q Exactive MS/MS）证实了酶解物中VPW的存在。半定量分析估计VPW约占BCA反应性肽/蛋白当量的1.56%；该值为估计值，并非VPW的绝对浓度或已验证的质量分数。在百草枯损伤的HaCaT细胞中，0.2 μg/mL VPW使细胞活力提高9%，总超氧化物歧化酶（SOD）活性提高71%，同时使丙二醛（MDA）积累降至接近未处理对照组水平。功能富集分析提示AKT/FoxO通路可能参与所观察到的生物学效应。在测试的短期H?O?暴露条件下，VPW减少了花青素-3-O-葡萄糖苷（C3G）的降解，且VPW–C3G联合处理对H?O?诱导的HaCaT细胞氧化损伤提供了比单独C3G更强的保护作用。上述发现将VPW鉴定为一种在酶解物中估计相对含量较低的候选抗氧化肽。需通过靶向定量和通路水平验证来确定其绝对丰度并阐明其作用机制。
氧化应激是生物组织细胞损伤和功能衰退的关键驱动因素。在皮肤和上皮细胞中，过量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）可破坏膜完整性、扰乱抗氧化酶系统、促进脂质过氧化并降低细胞活力，进而 contributing to 炎症、光老化及其他氧化应激相关疾病。兼具营养价值和细胞保护活性的天然抗氧化剂因此在功能性食品和药妆产品中受到日益广泛的关注。其中，生物活性肽因其结构多样性、相对较低的毒性、良好的吸收性以及通过自由基清除、金属螯合、抗氧化酶调控和氧化还原相关信号通路调节氧化应激的能力，成为颇具前景的候选分子。然而，新的可持续蛋白质来源和痕量抗氧化肽仍有待探索。
微藻是用于生物活性肽开发的可持续且尚未充分利用的蛋白质资源。微拟球藻（*Nannochloropsis oceanica*）是一种海洋微藻，因其高光合效率和丰富的二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）而被广泛用于饲料和油脂生产。其脂质提取物和类胡萝卜素已被证实与缓解氧化应激、神经炎症、淀粉样变性和紫外线诱导的皮肤细胞损伤相关。相比之下，尽管微藻蛋白和肽日益受到关注，微拟球藻的蛋白质组分仍未得到充分利用。此外，其坚硬的细胞壁和微小的细胞尺寸使蛋白质回收和低丰度肽的发现面临技术挑战。酶解和低分子量组分分离因此可能为将该未充分利用的蛋白质资源转化为抗氧化肽原料提供一条实用途径。
花青素稳定化是抗氧化制剂开发中的另一个重要挑战。花青素-3-O-葡萄吡喃糖苷（cyanidin-3-O-glucoside, C3G）是存在于浆果和其他有色植物材料中的代表性花青素，具有抗氧化、抗炎和细胞保护活性。然而，其在中性至碱性pH、热、光、氧和氧化条件下的稳定性较差，限制了其应用。蛋白质水解物和肽可通过非共价相互作用、抗氧化微环境形成或对细胞氧化应激的互补调节来改善花青素的稳定性和功能性。多酚-蛋白质和多酚-肽相互作用已被认为是改善多酚稳定性和调节生物活性的有效策略。例如，酪蛋白水解物可与C3G相互作用并影响抗氧化能力，而鳕鱼皮胶原蛋白水解物已被证明可改善蓝莓花青素的稳定性。然而，微藻肽是否能同时作为细胞保护性抗氧化剂和C3G的稳定化伴侣仍不清楚。
计算筛选可加速从复杂蛋白质资源中发现抗氧化肽。虚拟胃肠消化、理化性质预测、生物活性评价、网络药理学和分子对接可帮助优先排序候选肽，并推断与氧化应激和炎症相关的肽-靶点-通路关系。然而，这些预测仍是间接的，必须通过肽段鉴定、定量分析和基于细胞的 Functional validation 来支持。
HaCaT细胞是一种永生化人角质形成细胞系，被选为皮肤相关的体外模型，因为角质形成细胞是表皮中的主要细胞类型，在维持皮肤屏障稳态和响应氧化及环境应激中发挥重要作用。由于氧化应激是皮肤损伤的重要促进因素，且与抗氧化类化妆品成分的评价高度相关，HaCaT细胞为皮肤相关研究中初步评估此类成分对表皮细胞的保护作用提供了实用且可重复的模型。
在本研究中，研究人员开发了一种整合的计算筛选-实验验证工作流程，以从微拟球藻蛋白水解物中发现抗氧化肽。通过虚拟胃肠消化生成候选肽，使用生物信息学工具进行筛选，随后进行靶点-网络分析和分子对接。选定的三肽VPW在活性低分子量肽组分中被鉴定并进行半定量，其对抗氧化损伤的保护作用在HaCaT细胞中得到验证。此外，还利用化学和细胞模型评估了VPW在短期H?O?暴露下减少C3G降解的能力以及C3G的细胞抗氧化功效。本研究旨在鉴定微藻抗氧化肽，并探索其在VPW标准化肽原料和肽-花青素抗氧化制剂中的潜在应用。
研究方法方面，研究人员首先从UniProtKB获取微拟球藻三种主要蛋白的氨基酸序列，使用BIOPEP-UWM进行模拟胃肠消化（胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶A），保留含2-8个氨基酸残基的肽段。通过SwissTargetPrediction和PharmMapper预测肽段相关靶点，与来自GeneCards、OMIM和DisGeNET的衰老相关疾病靶点取交集，利用STRING构建高置信度蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络。使用PeptideRanker、ToxinPred、AllerTOP、SwissADME和PlifePred分别评估肽段的生物活性、毒性、致敏性、胃肠吸收和血浆半衰期。根据度中心性（degree centrality, DC）筛选核心肽段，利用DAVID进行通路富集分析。选取排名前六的NOBP与六个核心靶点进行半柔性分子对接。实验部分，研究人员在无菌条件下培养微拟球藻，经冻融循环和超声破碎后，依次用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶A进行酶解，通过超滤获得<1 kDa组分。利用三维荧光光谱对VPW进行初步验证，采用UPLC-Q Exactive MS/MS确认VPW的存在，并建立基于荧光检测的半定量方法。细胞实验中，研究人员使用CCK-8法评估VPW的细胞毒性及其对百草枯（paraquat, PQ）和H?O?诱导损伤的HaCaT细胞的保护作用，检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量。采用pH示差法评估VPW对C3G在H?O?条件下降解的保护作用，并通过组合指数（combination index, CI）分析评价VPW与C3G的协同效应。
主要研究结果如下：
3.1 微拟球藻候选抗氧化肽的计算优先排序：通过对三种代表性微拟球藻蛋白进行模拟胃肠消化，获得356条独特短肽。经过逐步筛选，最终根据网络拓扑分析和通路覆盖度确定六个核心靶点（AKT1、IL1B、CASP3、EGFR、MMP2和MMP9）。分子对接结果显示所有六种优先肽与核心靶点均表现出良好的预测结合亲和力（低于?6.0 kcal/mol），其中VPW展现出最佳的总体多靶点结合特性，平均对接分值最低。综合网络中心性、靶点覆盖度、对接性能和预测抗氧化活性，VPW被选为先导肽进行后续实验验证。
3.2 微拟球藻酶解物中VPW的鉴定与半定量：三维荧光光谱显示酶解物与合成VPW标准品在Ex 270–290 nm/Em 350–370 nm处具有相似的特征荧光峰，提示酶解物中存在含色氨酸的肽类成分。UPLC-Q Exactive MS/MS分析在61.77 min处检测到清晰的色谱峰，前体离子m/z 401.210与VPW的理论[M+H]?离子（401.2173）一致，MS/MS谱图中b?-H?O碎片离子（m/z 179.12）进一步支持VPW的存在。基于荧光检测的半定量方法在0–20 μg/mL范围内呈现良好线性（R2 = 0.995），检测限为0.011 μg/mL，定量限为0.034 μg/mL，加标回收率为94.50%。分析估计<1 kDa组分中VPW表观当量浓度为1.68 ± 0.02 μg/mL，约占BCA反应性肽/蛋白当量的1.56%。
3.3 VPW对PQ损伤HaCaT细胞的抗氧化活性：细胞相容性实验显示，VPW在0.02–2.00 μg/mL浓度范围内未降低HaCaT细胞活力，反而在2.00 μg/mL时使细胞活力提高21.03%。使用150 μM PQ建立氧化损伤模型（细胞活力降至对照的61.5%），VPW在0.20和0.50 μg/mL浓度下分别使细胞活力显著提高8.57%和18.59%。VPW处理还显著恢复SOD活性（0.20 μg/mL时从12.65 ± 0.56恢复至21.76 ± 1.92 U/mg蛋白），并将MDA含量从4.53 ± 1.08降至0.66 ± 0.25 nmol/mL。网络富集和分子对接提示VPW可能通过AKT/FoxO、PI3K-Akt和MAPK信号通路发挥作用。
3.4 VPW增强C3G的氧化保护和细胞抗氧化功效：在pH 7.0条件下，VPW-C3G复合物在25 μg/mL H?O?下使C3G保留率从85.91%提高至91.55%，在50 μg/mL H?O?下从74.69%提高至82.32%。在H?O?损伤的HaCaT细胞中，160 μg/mL的VPW-C3G复合物使MDA含量从C3G单独处理组的4.74 ± 0.22降至3.99 ± 0.07，MDA抑制率达87.28%，比游离C3G高29.18个百分点。组合指数计算为0.482，表明VPW与C3G在抑制脂质过氧化方面具有协同效应。
3.5 VPW基抗氧化原料的转化潜力与未来展望：基于荧光分析获得的VPW当量浓度（1.68 μg/mL）与细胞实验所用浓度（0.2–0.5 μg/mL）的比较支持了所测浓度在酶解物检出的浓度范围内，但该比较应视为浓度相关性的估计值。VPW作为<1 kDa微藻肽原料的潜在质量控制标记物具有研究价值。
讨论部分指出，VPW的抗氧化活性可能与其结构特征有关：色氨酸残基可通过吲哚环介导的自由基清除发挥作用，而脯氨酸和缬氨酸可增强肽的疏水性、稳定性和细胞可及性。VPW对C3G的保护作用可能归因于两者之间的氢键和疏水相互作用形成的局部保护性微环境。研究结论部分翻译如下：
本研究建立了一个整合的虚拟-实验工作流程，用于从微拟球藻中发现抗氧化肽并评估其在肽-花青素体系中的应用。VPW被鉴定为先导三肽，并在百草枯损伤的HaCaT细胞中通过实验验证了其细胞保护性抗氧化活性。荧光分析提供了活性<1 kDa组分中VPW当量含量的初步半定量估计，但该信号也可能反映其他含色氨酸化合物和基质效应。VPW特异性定量（如靶向液相色谱-串联质谱法）是确定其绝对丰度所必需的。VPW–C3G复合物在H?O?损伤的HaCaT细胞中表现出比单独C3G更强的抗脂质过氧化作用。总体而言，这些发现支持VPW作为一种有前景的微藻抗氧化肽，并为进一步研究含VPW的原料和肽-花青素制剂提供了基础。
