《Gynecologic Oncology》：LMOD1 expression and survival in uterine leiomyosarcoma: discordant results in tissue microarrays and whole sections
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背景：既往研究报道，在合并子宫与非子宫来源肿瘤的分析中，平滑肌蛋白1（LMOD1）与平滑肌肉瘤（LMS）较长生存期相关。本研究旨在分析LMOD1在1组纯子宫来源LMS（uLMS）大样本中的表达及预后作用。方法：采用免疫组织化学（IHC）方法，对244例uLMS
背景：既往研究报道，在合并子宫与非子宫来源肿瘤的分析中，平滑肌蛋白1（LMOD1）与平滑肌肉瘤（LMS）较长生存期相关。本研究旨在分析LMOD1在1组纯子宫来源LMS（uLMS）大样本中的表达及预后作用。方法：采用免疫组织化学（IHC）方法，对244例uLMS的组织微阵列（TMA）切片和203例uLMS的全切片进行LMOD1蛋白表达分析，其中134例同时纳入两组。评估其表达与临床病理参数及疾病特异性生存（DSS）的相关性。结果：TMA在221/244例（91%）肿瘤中可判读，其中100例（45%）表达LMOD1。在156例有临床数据的患者中，未观察到其与DSS的显著相关性。在全切片染色组中，LMOD1在142/203例（70%）肿瘤中表达，且较高表达与显著延长的生存期相关（203例有生存数据患者；p＝0.007）。后一组中与生存相关的其他参数包括FIGO分期（p＜0.001）、肿瘤直径（p＜0.001）、核分裂象计数（p＜0.001）、异型性程度（p＝0.006）及淋巴血管侵犯（LVSI；p＝0.006）。在Cox多因素分析中，FIGO分期（p＜0.001）、核分裂象计数（p＜0.001）、肿瘤直径（p＝0.001）及LMOD1表达（p＝0.003）为独立预后因素。结论：全切片中LMOD1表达是uLMS患者较长生存的新候选标志物。本研究进一步凸显了在生物标志物研究中使用TMA切片较全切片存在的局限性。
一、研究背景与存在问题
子宫肉瘤属罕见肿瘤，占子宫恶性肿瘤的不足5%，其中平滑肌肉瘤（leiomyosarcoma，LMS）为最常见类型。多数子宫LMS（uterine LMS，uLMS）具有梭形细胞形态，诊断需满足3项形态学参数（中度或重度异型性、肿瘤细胞坏死、核分裂象计数＞10个/10个高倍视野）中的至少2项，黏液样与上皮样亚型罕见。经典型/梭形细胞uLMS具有复杂基因组特征，包括TP53、RB1和/或ATRX突变，10号、11q、13、16q及17p染色体DNA拷贝数改变，以及称为染色体碎裂（chromothripsis）的极端染色体不稳定形式。约半数患者初诊时即伴子宫外病变，不同系列报道的5年生存率为42%~76%。治疗以手术为主，化疗、放疗和靶向治疗效果有限，在具有经验的多学科团队专科中心治疗至关重要。
LMOD1基因编码平滑肌蛋白1，最初从人甲状腺cDNA文库中克隆，其后证实富集于平滑肌，可结合原肌球蛋白，并作为3个基因旁系同源物之一参与原肌球蛋白相关的肌动蛋白单体成核。LMOD1缺失可导致一种罕见常染色体隐性遗传病——巨大膀胱微结肠肠蠕动不良综合征，该先天性肌病累及膀胱和结肠，表现为平滑肌收缩力受损。
既往对99例LMS（其中49例子宫来源、49例软组织来源、1例部位数据缺失）进行的基因表达谱分析（3′端RNA测序）识别出I-III 3种分子亚型，其中I型组疾病特异性生存（disease-specific survival，DSS）较长，LMOD1在mRNA和蛋白水平均为I型肿瘤的标志物。值得注意的是，uLMS存在于全部3种亚型中，所观察到的生存差异主要归因于子宫外LMS病例。鉴于uLMS预后标志物研究常受队列规模小、且常与软组织肉瘤或其他组织学类型子宫肉瘤混合分析所限，本研究旨在1组纯子宫来源LMS大样本中分析LMOD1的表达及其临床作用。
二、主要关键技术方法
研究纳入两个系列：TMA系列为1970—2000年挪威全部子宫肉瘤中心病理复核中的244例uLMS（221例梭形细胞、17例黏液样、6例上皮样），每例取3个代表性区域0.6 mm穿刺芯制备TMA；全切片系列为1970—2018年挪威诊断的203例uLMS（其中155例来自1970—2000年、48例为2001—2018年挪威镭医院新诊断治疗病例），两系列共有134例重叠。采用Dako EnVision Flex+系统对LMOD1（兔多克隆抗体HPA28325，1:100稀释，pH 6缓冲液抗原修复）行免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色，由对临床病理资料设盲的妇科病理学家评分：染色范围0~3分（0＝无染色，1＝1%~10%，2＝11%~50%，3＝51%~100%）与强度0~2分相乘得0~6分，预设低表达（0~2分）与高表达（3~6分）分组。采用SPSS-PC（Version 31）软件，Mann-Whitney检验分析表达与临床病理参数关系，Kaplan-Meier法和log-rank检验行单因素生存分析，Cox回归模型（Enter法）行多因素分析，p＜0.05为差异有统计学意义。
三、研究结果
（一）LMOD1在TMA与全切片系列中的表达
TMA系列244例中221例含足量肿瘤可评估，LMOD1阳性100/221例（45%），评分分布为1分24例（24%）、2分22例（22%）、3分36例（36%）、4分1例（1%）、6分17例（17%）。全切片系列203例全部可判读，LMOD1阳性142/203例（70%），评分分布为1分12例（8%）、2分29例（20%）、3分65例（46%）、4分1例（1%）、6分35例（25%）。1970—2000年病例与2001—2018年病例的LMOD1表达无显著差异（p＞0.05）。按预设界值，两系列结果一致率为66%（89/134例；58例均为低评分，31例均为高评分），其余45例中35例TMA低评分而全切片高评分，10例相反。LMOD1表达与较年轻年龄显著正相关（TMA队列p＝0.005，全切片系列p＝0.002），与FIGO分期、肿瘤直径、核分裂象计数、异型性程度、坏死及血管侵犯均无显著相关。
（二）TMA队列的生存分析
156例有临床数据的uLMS患者随访1~559个月（均值106个月，中位45个月），末次随访时110例死于疾病、25例无病存活、20例死于无关原因、1例失访。低评分与高评分患者DSS无显著差异（p＝0.657；低评分113例中位DSS 34个月vs高评分43例57个月）；以任何水平表达为界值（0分vs 1~6分）分析时，LMOD1阳性肿瘤患者（75例，中位59个月）较阴性者（81例，中位29个月）呈生存延长趋势（p＝0.075）。
（三）全切片队列的生存分析与多因素分析
203例患者随访2~584个月（均值93个月，中位37个月），末次随访时148例死于疾病、1例带病存活、23例无病存活、30例死于无关原因、1例失访。高评分患者DSS显著长于低评分者（p＝0.007；高评分101例中位60个月vs低评分102例28个月）；按阳性vs阴性分析则不显著（p＝0.193）。全队列中与DSS显著相关的临床病理参数包括FIGO分期（p＜0.001；I期142例中位62个月，II期28例37个月，III期14例10个月，IV期19例11个月）、肿瘤直径（p＜0.001；＞10 cm者60例中位23个月vs≤10 cm者131例62个月）、高核分裂象计数（p＜0.001；＞10个/10 HPF者110例中位29个月vs≤10个者79例99个月）、异型性程度（p＝0.006；中/重度者180例中位35个月，轻度者19例未达中位）及LVSI（p＝0.006；有LVSI者72例中位29个月vs无者116例62个月）。年龄（p＝0.096）与坏死（p＝0.625）与生存无显著相关。将p＜0.2的参数纳入Cox多因素分析（174例），FIGO分期（p＜0.001）、核分裂象计数（p＜0.001）、肿瘤直径（p＝0.001）及LMOD1表达（p＝0.003，风险比0.57）为独立预后因素。
四、讨论与结论
与许多罕见肿瘤一样，uLMS生物标志物的临床相关性研究常受队列规模小的限制，可能因检验效能不足产生假阴性数据；且uLMS常被纳入软组织肉瘤或其他组织学类型子宫肉瘤的研究中，进一步增加了复杂性。本研究共分析290例uLMS，为迄今研究规模最大的uLMS队列之一。Guo等对99例LMS（49例uLMS）的RNA测序识别出I-III 3种分子亚群，I型组DSS较长，uLMS分别占I、II、III亚型的26%、59%和92%，但并非所观察生存差异的驱动因素。其后续研究分析TCGA数据库中29例uLMS，将肿瘤分为I、II两亚型，LMOD1在I型（低级别、具平滑肌特征、对化疗反应略有改善，p＝0.04）中过表达；在IHC分析的68例I亚组肿瘤中LMOD1表达于51例，但未提供68例II亚组肿瘤的表达数据。平滑肌肉瘤较平滑肌瘤和正常子宫肌层常出现肌肉标志物表达降低，因此TMA中取样阴性区域可能导致阳性率低于全切片，后者能更细致地反映肿瘤异质性。本研究TMA切片阳性率为45%，全切片为70%，两系列均检测的肿瘤一致度为中等。TMA因显著降低试剂与工作量成本而广泛用于生物标志物研究，本课题组既往uLMS研究亦采用TMA；但本研究结果提示全切片染色所得结果可能与TMA显著不同。在多种标志物研究中全切片可能难以实施，但在分析少数或单一标志物时应予考虑。LMOD1表达曾报道与平滑肌分化相关，An等的研究中其在分化程度较高的LMS中更高；然而本研究中LMOD1表达在两个队列中均与异型性程度或核分裂象计数无关，可能与本研究系列与上述研究的固有差异有关，其中第一项研究属实验性研究。仅有少数生物标志物被报道与uLMS生存独立相关：胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3（IMP3）、细胞周期蛋白依赖性激酶8（CDK8）及细胞周期蛋白依赖性激酶亚基（CKS）2表达与较差生存相关，C反应蛋白（CRP）和γ-谷氨酰转移酶血清水平亦如此；本课题组此前报道孕激素受体和stathmin在TMA uLMS系列中具独立预后作用。除患者年龄外，LMOD1表达在两个队列中与临床病理参数无关，且在TMA系列中与DSS无显著相关；但在全切片系列中LMOD1表达与DSS显著相关，并在多因素分析中为独立预后因素。该系列的临床可靠性得到FIGO分期、肿瘤直径、核分裂象计数、异型性程度和LVSI等公认临床病理参数与生存强相关的支持。本研究存在若干局限性：最早病例始于1970年，部分患者在其他机构治疗，当前常规报告的部分参数（如子宫浆膜受累）数据不完整，故未纳入统计分析，无复发病生存数据亦然；但在包括DSS在内的大多数公认临床病理参数方面，＞200例患者数据可得。非专科肿瘤医院的治疗可能因手术范围和非手术治疗质量差异影响患者生存，许多外院患者缺乏辅助治疗数据。最后，使用跨度近50年的石蜡块可能造成抗原性差异，尽管本研究中1970—2000年诊断肿瘤与2000年后标本间未观察到显著差异。
结论：LMOD1表达是uLMS患者较长生存的新候选标志物。本研究进一步凸显了在生物标志物研究中使用TMA切片较全切片可能存在的局限性，主要源于上述两种方法检测LMOD1阳性病例的差异。该差异提示，在小的术前活检中评估LMOD1表达可能受肿瘤异质性所限。
