固态发酵与低水分挤压联合处理下蚕豆蛋白-燕麦粉混合物中美拉德反应的进程研究

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Maillard reaction in fava bean protein and oat flour blends under solid-state fermentation and low-moisture extrusion

　　

固态发酵（SSF）和低水分挤压（LME）是两种应对植物基成分日益增长需求而受到关注的加工策略。尽管它们会引发重要的化学转化，但在这些过程中发生的美拉德反应（MR），尤其是当两种策略结合使用时，其机制仍不清楚。因此，本研究调查了在LME、SSF（包括灭菌和干燥）以及两者联合应用于蚕豆蛋白浓缩物和燕麦粉混合物（50-50%，80-20%）过程中MR的进程。对未发酵原料进行LME导致有限的MR发展，表现为未检测到果糖胺以及荧光晚期糖基化终末产物（AGEs）的低水平形成。相比之下，对灭菌样品进行SSF促进了蛋白质修饰，表现为游离氨基增加了8.6倍，从而增强了MR反应性。在SSF后的干燥阶段，新的果糖胺形成表明早期MR阶段被激活。干燥后荧光AGEs增加了2.1倍，反映了向高级MR阶段的进展。在SSF和LME联合处理后，相对于SSF和干燥阶段，游离氨基、果糖胺和荧光AGEs均有所下降，这与挤压过程中最终MR产物的形成一致。这一点进一步得到支持：与单独LME（应用于未发酵原料）相比，赖氨酸含量降低了17%，而Nε-羧甲基赖氨酸（CML）水平增加了117%。高级MR也反映在颜色变深和类黑精指数增加上，尤其是在80-20%的混合物中。总体而言，灭菌、SSF和干燥的联合效应促进了MR前体物的形成，而随后的挤压则推动了反应向高级和最终阶段发展。

论文解读

一、研究背景与目的

全球大部分供人类消费的蛋白质来自动物源，但集约化畜牧业对环境可持续性造成显著影响。植物蛋白，特别是来自豆类和谷物的蛋白，因其公认的营养价值和较低的环境影响而被视为有前景的替代品。蚕豆是一种富含碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质及具有降胆固醇和抗氧化作用的生物活性化合物的豆类。燕麦是一种营养密集的谷物，具有高抗氧化活性、主要由β-葡聚糖带来的低血糖生成指数以及低致敏性。将豆类和谷物结合可以改善氨基酸平衡，因为豆类含硫氨基酸有限，而谷物则缺乏赖氨酸。

然而，植物蛋白通常由于其特定的结构复杂性和抗营养化合物的存在，表现出比动物蛋白更低的消化率和生物利用度。这些限制可以通过适当的预处理或加工策略来缓解。固态发酵（SSF）是一种对植物基成分的生物改性方法，可以提高氨基酸生物利用度、降低糖含量并产生生物活性化合物。低水分挤压（LME）则通过施加机械能和热能引起蛋白质展开和变性，从而提高酶的可及性和蛋白质消化率。将SSF与挤压结合已被提议作为一种增强植物基成分营养、理化和感官特性的策略。

在SSF（如灭菌和干燥）以及挤压过程中施加的高温会诱导美拉德反应（MR）。SSF引起的生化改变可能会改变MR前体物（包括游离氨基和还原糖）的可用性和可及性。因此，发酵后的底物对后续挤压过程中的热机械处理可能产生不同的响应，从而导致两个加工阶段之间的协同效应。尽管已有研究涉及发酵或挤压产品中的MR，但据研究人员所知，尚无研究探讨这两种工艺的组合或其在不同加工阶段潜在的协同效应。鉴于美拉德衍生化合物可作为加工强度和产品质量的化学指标，本研究旨在评估使用糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）进行SSF和低水分挤压处理两种蚕豆蛋白浓缩物/燕麦粉混合物过程中，早期、中期和晚期美拉德反应标志物的进程，并探讨其在监测和控制这些过程中的潜在用途。

二、关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：

1. 1.
   固态发酵（SSF）：采用糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）M2191菌株对灭菌后的原料混合物进行为期14天、温度28°C的发酵。
2. 2.
   低水分挤压（LME）：使用实验室规模双螺杆挤出机进行，设置特定的温度区（最高至110°C）和螺杆转速（600 rpm）。
3. 3.
   美拉德反应（MR）指标分析：通过碱性提取制备样品，随后测定游离氨基（OPA法）、果糖胺（NBT法）、总荧光晚期糖基化终末产物（AGEs）（荧光光谱法）、有色高级产物/类黑精（高分子量组分在405 nm处的吸光度，并以焦糖色素为对照）、以及赖氨酸和羧甲基赖氨酸（CML）含量（离子交换色谱法）。
4. 4.
   理化性质测定：包括水分含量（烘箱干燥法）、pH值测定和色差分析（CIELAB色空间）。

三、研究结果

3.1. 低水分挤压（工艺A）

挤压过程显著增加了游离氨基含量（从1.20增至3.76 μmol N^α-乙酰-L-赖氨酸/ mg可溶性蛋白），这归因于蛋白质变性和抗营养因子减少。果糖胺未被检测到。荧光AGEs显著增加（从5.23增至48.53 nmol奎宁硫酸盐/ mg可溶性蛋白），表明MR进入了更高级阶段。高分子量类黑精也显著增加（从7.21增至12.02 mg焦糖/g干物质），并与颜色变暗（L降低，a和b*升高）相一致。水分含量从8.03%升至11.41%，处于促进MR的水平。

3.2. 联合SSF和挤压（工艺B）

3.2.1. 灭菌对原料的影响

灭菌显著增加了游离氨基，其中50-50%混合物的增幅（从1.15到4.15 μmol N^α-乙酰-L-赖氨酸/ mg可溶性蛋白）大于80-20%混合物（从1.23到2.63）。荧光AGEs也显著增加，且在80-20%混合物中增幅更大（从5.98到37.12 nmol奎宁硫酸盐/ mg可溶性蛋白），这可能与其更高的还原糖含量有关。果糖胺和高分子量类黑精未检出。颜色变暗（L降低，a和b*升高）。

3.2.2. SSF对灭菌样品的影响

SSF过程使游离氨基大幅增加（从3.39增至29.05 μmol N^α-乙酰-L-赖氨酸/ mg可溶性蛋白），这归因于糙皮侧耳的蛋白酶解活性。荧光AGEs显著增加（从29.85增至297.83 nmol奎宁硫酸盐/ mg可溶性蛋白）。高分子量类黑精重新出现并显著增加（达到21.33 mg焦糖/g干物质）。pH值从6.71升至7.95，碱性条件有利于MR进行。颜色进一步加深（L降低，a升高，b*降低）。

3.2.3. 干燥对发酵样品的影响

干燥过程使果糖胺首次被检测到（6.91 μmol DMF/ mg可溶性蛋白），表明早期MR被激活。荧光AGEs继续显著增加（从297.83增至633.99 nmol奎宁硫酸盐/ mg可溶性蛋白）。高分子量类黑精也显著增加（从21.33增至28.79 mg焦糖/g干物质）。游离氨基无显著变化。水分急剧降低（从65.38%降至7.80%），促进了MR。

3.2.4. 挤压对干燥样品的影响

挤压过程导致游离氨基（从38.58降至22.79 μmol N^α-乙酰-L-赖氨酸/ mg可溶性蛋白）和果糖胺（从6.91降至1.91 μmol DMF/ mg可溶性蛋白）显著减少，表明这些前体物参与了更高级的MR。荧光AGEs也显著下降（从633.99降至285.53 nmol奎宁硫酸盐/ mg可溶性蛋白），可能转化为非荧光产物。高分子量类黑精在80-20%混合物中显著增加（从28.29增至41.30 mg焦糖/g干物质），而在50-50%混合物中却降低，可能与高剪切力下的降解有关。颜色变化（L降低，a升高）与类黑精形成一致。

3.2.5. SSF和低水分挤压的协同效应

研究表明，SSF（特别是结合灭菌和干燥）通过增加游离氨基的暴露，促进了后续挤压过程中的MR。这种促进作用并非完全由糙皮侧耳的活动单独引起，灭菌导致的基质重组（如凝胶形成）和干燥步骤也贡献显著。

3.3. 最终干燥挤出物中的赖氨酸和CML含量

与工艺A（仅挤压）相比，工艺B（SSF+挤压）的最终产品中赖氨酸含量显著降低（从71.15降至59.29 mg/g总氨基酸），而羧甲基赖氨酸（CML）含量显著增加（从22.75增至49.27 μg/g样品，干重）。CML的增加与更高级的MR进程相符，而赖氨酸的减少可能部分源于真菌代谢。

四、讨论与结论

本研究的讨论部分指出，工艺A和B展现了不同的MR模式，工艺B的MR活性更高。这归因于工艺B在挤压前经历的灭菌、SSF和干燥等组合处理，这些处理促进了蛋白质修饰，增加了游离氨基的可用性，从而提高了系统的反应活性。此外，水分和pH的变化在调节MR进程中起着关键作用。

研究结论总结如下：当比较最终的挤压工艺（A和B）时，工艺B中的CML水平显著更高，这与不同加工阶段中更高级的MR进程一致。工艺B中的赖氨酸含量也有所下降，这可能是其参与MR、被真菌代谢或两者共同作用的结果。总体而言，灭菌和糙皮侧耳SSF的组合通过增加反应性氨基的暴露，起到了促进MR的作用，而随后的热处理则是推动高级MR发展的主要驱动力。观察到的效果可能因真菌菌株以及发酵和干燥条件而异，可能导致不同的MR模式和产物水平。因此，应仔细调整和控制加工条件，特别是温度，以尽量减少如CML等不良MR化合物的形成。此外，本研究中使用的MR指标为了解MR进程的方向和程度提供了宝贵见解，其中CML作为确认MR进展的有效生物标志物。