荷兰全国范围内环孢子虫分子检测的实验室间比对研究

《PLOS One》：Interlaboratory comparison of molecular detection of Cyclospora cayetanensis in routine diagnostic laboratories

　　

摘要 目的：尽管环孢子虫的分子检测越来越多地被整合到多重胃肠道诊断工作流程中，但针对环孢子的专门外部质量评估（external quality assessment, EQA）项目仍然有限。研究人员开展了一项全国性的实验室间比对研究，以评估荷兰分散式ISO15189认可实验室对环孢子虫的常规分子检测能力。 方法：研究人员将一个包含11份样本的匿名化样本组（包括未保存粪便标本和eNAT保存的粪便悬液）分发至荷兰（n=8）和库拉索（n=1）的实验室。各实验室使用其常规诊断工作流程进行分析。通过结构化问卷收集了工作流程特征、DNA提取程序、分子平台和判读标准。由于隐孢子虫通常在同一工作流程中进行检测并面临相似的提取挑战，因此隐孢子虫阳性样本被纳入作为内部工作流程对照。此外，还收集了汇总的回顾性实验室数据，以探索监测可行性并了解环孢子虫和隐孢子虫的季节性规律。 结果：七个实验室进行了环孢子虫的分子检测，而所有九个实验室均进行了隐孢子虫的检测。隐孢子虫检测实现了完全的定性一致。对于环孢子虫，总体定性一致性较高，但在核心样本中出现了一例假阳性和三例假阴性结果。不同实验室对低阳性教育样本的检测差异显著，表明在接近检测特异性检测限时重复性降低。本研究表明，eNAT保存的粪便悬液在常温运输条件下保持稳定。回顾性实验室数据显示，环孢子虫全年呈低水平检出，而隐孢子虫阳性率在夏末和秋季呈现季节性升高。 结论：在分散式诊断实验室中，环孢子虫的常规分子检测显示出良好的总体实验室间一致性。然而，对于低阳性样本，重复性有所下降，这凸显了检测验证、外部质量评估以及对弱阳性环孢子虫PCR结果谨慎解读的重要性。

论文解读文章

研究背景与问题

环孢子虫是一种肠道球虫寄生虫，可引起食源性和水源性胃肠疾病，感染后常导致迁延性或复发性水样腹泻，若诊断和治疗延迟可造成显著的发病负担。尽管环孢子虫感染在热带和亚热带地区更为常见，欧洲地区的病例主要通过旅行者和食源性传播（包括与进口新鲜农产品相关的暴发疫情）发生。随着多重胃肠道分子诊断技术的日益普及，常规临床微生物学实验室对环孢子虫的检出率可能随之增加。准确的检测对于个体患者管理、暴发识别和公共卫生监测具有重要意义。

实时荧光PCR因其更高的分析灵敏度、更高的通量以及与综合征性胃肠道检测的兼容性，已在很大程度上取代了显微镜检查用于肠道原虫的常规检测。然而，不同的分子工作流程在标本处理、DNA提取、PCR靶标、引物和探针序列、扩增平台以及判读标准方面可能存在显著差异。这种异质性对于环孢子虫而言尤为重要，因为其卵囊密度低、间歇性排虫以及有限的检测标准化程度，都会影响在接近分析检测限时的重复性。

参与外部质量评估项目是ISO15189认可的医学微生物学实验室的重要组成部分。虽然针对多种肠道原虫存在外部质量评估计划，但针对环孢子虫分子检测的专门质量评估仍然有限。因此，关于分散式实验室网络中环孢子虫常规分子诊断的重复性知之甚少。本研究的主要目的是在荷兰和库拉索开展一项针对环孢子虫常规分子检测的实验室间比对。次要目标包括利用隐孢子虫样本评估工作流程稳健性，评估eNAT保存的粪便悬液用于分散式样本分发的可行性，以及探索回顾性实验室数据用于监测目的。

研究方法与技术

本研究由荷兰埃尔斯特的Dicoon医学微生物学与免疫学实验室协调，共有9家实验室参与，其中8家位于荷兰，1家位于库拉索。参与实验室收到一份匿名化样本组和一份结构化问卷，涵盖诊断算法、提取工作流程、样本输入量和洗脱体积、分子平台、PCR靶标、循环阈值判读标准、年度检测量和阳性率等信息。样本组共包含11份标本：8份浓度约为100 mg/mL的粪便悬液（即两勺豌豆大小的粪便样本置于2 mL eNAT培养基中）和3份未保存的粪便样本。样本的选择旨在代表常规诊断中观察到的循环阈值范围，其中包括阴性和阳性标本，以及一份设计用于挑战接近检测限检测能力的低阳性教育样本。为评估运输过程中的稳定性，协调实验室在发货前以及模拟常温运输条件后重新检测了eNAT保存的样本。此外，还进行了额外的验证实验以评估eNAT中肠道原虫在长时间室温储存下的稳定性。参与实验室还被邀请提供过去12个月的汇总回顾性实验室数据，包括分析的粪便样本数量以及隐孢子虫和环孢子虫的阳性率。

研究结果

参与实验室与工作流程：九家实验室参与研究，其中七家实验室常规进行环孢子虫的分子检测，所有九家均进行隐孢子虫的分子检测。九个实验室共使用了十种分子工作流程，前处理包括机械破碎、酶裂解和非机械的粪便悬液处理方法。检测采用五种商业综合征或多重PCR工作流程和五种实验室开发的实时荧光PCR工作流程。

样本组稳定性：协调实验室的重新检测显示，在模拟常温运输条件下，循环阈值变化极小，通常在室温储存7天后保持在1个循环阈值以内。额外验证实验证明，eNAT保存的粪便悬液中肠道原虫在室温下可稳定保存长达8至11天。

环孢子虫和隐孢子虫的分子检测：对于环孢子虫，核心样本的总体定性一致性较高，大多数实验室正确识别了阳性和阴性标本。在69份核心样本结果中，观察到一例假阳性和三例假阴性结果。参与实验室中没有一家在核心样本中产生超过一个不一致结果。观察到的不一致主要与参考检测中产生高循环阈值的样本相关。商业检测和实验室开发的工作流程总体上均表现出可接受的定性性能。对于接近检测特异性检测限的低阳性样本，检测变异性显著增加。不同实验室对教育样本的检测差异很大，多个工作流程未能检测到该样本或产生的循环阈值超过了本地报告阈值。

环孢子虫的显微镜检查：四家实验室报告具备环孢子虫显微镜检查能力，但显微镜在常规诊断中很少使用，且相对于PCR报告的敏感性有限，尤其是对于低阳性样本。

隐孢子虫的检测性能：所有九家参与实验室均正确识别了所有隐孢子虫阳性和阴性样本，在异构的工作流程中实现了完全的定性一致性，未观察到假阳性或假阴性结果。尽管定性结果完全一致，但不同工作流程之间的循环阈值存在显著变异。

回顾性实验室监测数据：六家实验室提供了隐孢子虫的回顾性数据，五家提供了环孢子虫的数据。环孢子虫阳性率在整个研究期间保持低水平，无明显季节分布。相比之下，隐孢子虫阳性率在2024年8月至11月期间在医院和一线诊断人群中均呈现季节性升高。

讨论与结论

本项全国性实验室间比对研究表明，在荷兰和库拉索分散式ISO151989认可诊断实验室中，环孢子虫的常规分子检测具有良好的总体实验室间一致性，而隐孢子虫的分子检测则表现稳健。将隐孢子虫和环孢子虫置于同一比对样本组中，使得比较特定实验室针对两种寄生虫的性能以及病原体特异性检测成为可能。核心样本中仅有少数不一致结果，表明实验室流程整体稳健。在检测到低阳性样本与未检测到的实验室之间进行比较，未发现成功检测与特定的前处理方法之间存在明确的关联。

在病原体特异性层面，隐孢子虫实现的完全定性一致性令人欣慰，尽管参与实验室之间存在显著的方法学异质性。这些发现表明，当代分散式分子寄生虫学诊断尽管工作流程多样性显著，仍能实现稳健的定性性能。相比之下，环孢子虫的检测显示出更多变异性，尤其是在接近检测特异性检测限的样本中。低阳性环孢子虫样本的变异性可能反映了提取效率、样本异质性、低靶标浓度下的随机扩增、检测特异性分析灵敏度以及循环阈值判读标准差异的综合效应。

这些发现在临床上具有重要意义，因为多重胃肠道分子诊断的日益普及可能导致更频繁地检出历史上通过显微镜检查无法发现的低阳性环孢子虫样本。然而，弱阳性PCR结果的临床意义仍不确定。高循环阈值检出可能代表低卵囊密度、间歇性排虫、正在消退的感染或接近分析检测限的随机扩增。弱阳性结果应使用本地验证的、检测特异性的标准并结合适当的临床背景进行解读。鉴于工作流程之间存在显著异质性，不能推荐通用的循环阈值截断值。

一个重要的实践发现是在常温运输条件下分发eNAT保存的粪便悬液的可行性。运输模拟过程中观察到极小的循环阈值变异，这支持将eNAT保存的粪便标本用于未来分散式外部质量评估倡议和多中心分子寄生虫学研究。回顾性实验室数据还展示了常规分子诊断数据用于分散式公共卫生监测的潜在效用。尽管环孢子虫阳性率全年保持低水平，但隐孢子虫阳性率在夏末和秋季增加，这与先前在欧洲报道的季节性模式一致。

本研究存在若干局限性：参与实验室和分析的标本数量相对有限；参与实验室使用异构工作流程，阻碍了检测间的直接分析比较；大多数标本缺乏详细的临床元数据和正交确认性检测；仅纳入了有限数量的低阳性样本，限制了对接近分析检测限的检测重复性的详细评估；回顾性监测部分是探索性的，并非为正式流行病学分析而设计。

研究结论：在分散式ISO15189认可诊断实验室中，环孢子虫的常规分子检测显示出良好的总体实验室间一致性。然而，对于接近检测特异性检测限的低阳性样本，重复性有所下降，这凸显了持续进行检测验证、外部质量评估以及在常规临床微生物学中对弱阳性环孢子虫PCR结果谨慎解读的重要性。这些发现支持在分散式实验室网络中继续发展针对分子寄生虫学诊断的结构化质量保证举措。