《The Journal of Applied Laboratory Medicine》：Analytical Evaluation of Urinary CXCL10 as a Biomarker for Kidney Allograft Rejection
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**背景**：尿液C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10），作为一种白细胞募集趋化因子，是诊断肾移植排异反应（kidney transplant rejection）的灵敏且特异的生物标志物（biomarker）。研究人员参照美国临床和实验室标准协会
**背景**：尿液C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10），作为一种白细胞募集趋化因子，是诊断肾移植排异反应（kidney transplant rejection）的灵敏且特异的生物标志物（biomarker）。研究人员参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）指南，采用Meso Quickplex SQ 120平台对尿液样本中的CXCL10开展了全面的检测验证。
**方法**：评估了精密度（precision）、线性（linearity）、回收率（recovery）、冻融循环（freeze–thaw cycles）、血红蛋白（hemoglobin）、甘油三酯（triglyceride）、结合胆红素（conjugated bilirubin）及蛋白质的干扰（interference），以及批间变异（lot-to-lot variation）。新鲜尿液样本在处理前分别于室温（RT）放置1、2、4 h或于4°C放置1、2、4、24 h，随后在同一温度下以不同离心速度（400、800、1500、2000 g）和不同离心时间（6、10、20 min）进行离心。
**结果**：质控品（QC）及人尿液样本的批内精密度（within-run precision）和批间精密度（between-run precision）分别<7%和<15%，后者略大。线性范围高达900 ng/L，定量下限（limit of quantitation）为2.45 ng/L。尿液CXCL10的回收率为94%～102%。CXCL10在多达6次冻融循环中保持稳定。蛋白尿和胆红素尿未检出干扰。脂尿和重度血尿（血红蛋白，Hb = 5 g/L）被发现可干扰CXCL10测定。CXCL10在室温储存4 h及4°C储存24 h的未处理尿液中保持稳定。不同离心时间和速度对CXCL10测定无显著影响。
**结论**：尿液CXCL10具有良好的重现性（reproducibility），可按与其他临床尿液分析物相同的方式处理，表明其适合作为诊断性生物标志物用于肾移植术后患者的评估。
## 论文主体解读
**一、研究背景与问题提出**
肾移植是儿童终末期肾病的最优治疗手段，其死亡率较低且可改善长期神经认知结局。然而，尽管术后对移植肾进行了严密监测，长期移植物存活率仍不理想。据北美儿童肾脏试验与临床研究（NAPRTCS）报告，48个月内急性排异反应发生率接近40%。目前排异监测的金标准是肾活检，但该方法具有侵入性且费用高昂，并非所有患者均可实施。主要的无创监测手段为血清肌酐（Cr），其反映肾小球滤过率（GFR）及移植肾健康状况，但血清Cr在诊断上可能不敏感，无法检出排异反应的早期征象。因此，研究人员一直在探索可作为无创替代手段的新型生物标志物以监测移植物健康。
尿液C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10），又称干扰素γ诱导蛋白10（IP-10）和小诱导性细胞因子B10（SCYB10），是诊断和预测急性肾移植排异反应的灵敏、特异的生物标志物。CXCL10是一种10.8 kDa的蛋白，由浸润的炎症细胞、肾小管细胞和系膜细胞分泌。干扰素-γ（IFN-γ）诱导CXCL10产生，后者在移植肾排异反应中作为白细胞募集的趋化因子，并介导辅助性T细胞1（Th1）反应。因此，尿液CXCL10浓度的变化可作为移植物炎症的早期指征。然而，可能引入检测结果变异的因素包括采样时间、采集容器抗凝剂选择、样本处理、储存条件（温度与时长）、空腹状态以及离心时间和速度等。此外，理解检测方法的分析局限性及潜在干扰对结果解读至关重要。为促进新型生物标志物的临床转化，FDA和欧洲药品管理局等监管机构已提供审查和批准流程指南。CLSI亦针对实验室自建检测（LDTs）提供指南，以确保在临床应用前完成严格验证。根据该指南，实验室需为LDTs确立产品声明，包括准确度、精密度、检测限、分析特异性（含干扰物质）、可报告范围、参考区间等性能特征。本研究旨在评估回顾性和前瞻性采集的尿液样本中CXCL10的效度，以建立CXCL10检测的分析性能，并配套适当的质量保证框架供临床试验使用。本文呈现了尿液CXCL10的全面评估结果，涵盖其在Meso Scale Discovery（MSD）公司Meso QuickPlex SQ 120平台上的分析性能及分析前处理条件的影响，遵循CLSI关于建立性能声明的指南。
**二、主要关键技术方法**
本研究为质量保证项目，利用剩余患者尿液样本和新鲜采集尿液样本进行方法学评价，验证实验于2018年5月至2020年8月在BC儿童医院病理与检验医学部完成。研究人员从"利用生物标志物预测肾移植结局（PROBE）"多中心、前瞻性、观察性儿科研究中获取?80°C冻存的剩余尿液样本，用于评价批内和批间精密度、定量下限、线性、稀释线性、回收率、干扰及批间变异。同时经患者知情同意获取新鲜尿液样本（n = 14），用于评价样本预处理条件、离心及冻融的影响。尿液CXCL10采用基于微流控的电化学发光（ECL）免疫分析法测定，为96孔板格式的两步夹心免疫分析，使用仅含CXCL10的V-PLEX检测板，由Meso QuickPlex SQ 120成像仪读取光信号强度进行定量。各项性能评价分别参照CLSI EP17-ED2IG、EP06-ED2、EP34-ED1、EP25-ED2、EP07-ED3等文件进行。
**三、研究结果**
**精密度**：使用MSD质控品（15、75、566 ng/L）时，批内和批间精密度分别为4.4%、5.1%、4.4%和11.5%、12.6%、9.9%。使用患者尿液样本（5.9、94.8、264.1 ng/L）时批内精密度为5.6%、6.3%、6.7%，批间精密度（3.9、27.9、90 ng/L）为12%、8.7%、12.8%，即通过重复测定计算均值与变异系数（CV）并与试剂盒说明书比较得出精密度符合要求。
**定量下限、线性与稀释回收率**：CXCL10浓度为2.45 ng/L时CV为8.7%（n = 10），满足20%标准，故将本检测的定量下限（LLOQ）定义为2.45 ng/L。MSD的CXCL10方法线性高达900 ng/L，超过厂商声明的500 ng/L线性范围；稀释研究亦显示至4倍稀释具有优良线性。三个浓度（9.10、35.53、589.53 ng/L）的CXCL10样本加入MSD校准品（227.23 ng/L）后，回收率为94%～101%，即通过加标回收实验证实准确度良好、基质效应极小。
**冻融影响**：使用高、中浓度尿液样本（200和86 ng/L）检验6个冻融循环，所有CXCL10读数CV低于10%，与基线浓度的偏差保持在15%以下，即通过反复冻融实验证明样本稳定性良好。
**干扰研究**：以对照与加标样本差异在±2 ng/L（CXCL10 ≤20 ng/L）或±15%（CXCL10 >20 ng/L）为可接受标准，蛋白尿高达5 g/L及结合胆红素高达27.8 mg/dL未见干扰；重度血尿（Hb = 5 g/L）引起CXCL10测定的轻度负偏倚，而甘油三酯在132.7 mg/dL时开始呈现潜在正干扰，即通过加入干扰物质的对比实验明确了潜在干扰物。
**批间变异**：对来自4个不同批次的共17块板进行评估，偏倚范围为5%～22%，符合厂商25%的可接受标准。
**分析前评估**：研究人员在14例患者采集的17份新鲜尿液样本（约12 mL）中，测试了室温储存至4 h和4°C储存至24 h的未处理样本，并在不同离心速度和时长下离心，CXCL10水平变化极小（平均偏倚?0.42 ng/L），与标准条件（条件1：4°C、800 g、6 min）测得水平相似。样本6虽CXCL10均值最高（94.74 ng/L）且在不同条件下变异较大，但其CV为8%，仍在检测精密度规格之内。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，本研究依据CLSI关于LDTs的指南，全面评价了Meso QuickPlex SQ 120测定尿液CXCL10的性能，展示了评价研究型生物标志物并建立质量保证流程以支持临床试验的系统性方法，该思路亦可应用于其他厂商的CXCL10检测及其他临床试验中的生物标志物评价。本检测的可报告范围为2.45～900 ng/L、不精密度为4.4%～12.8%、回收率为94%～101%，满足厂商全部声明且分析上可接受。干扰研究显示，胆红素尿不干扰CXCL10测定，而尿液中的甘油三酯和高浓度Hb被确定为干扰物，这有助于在样本含脂质或肉眼血尿时解读CXCL10结果；本研究首次报道脂尿和重度血尿对尿液CXCL10免疫分析的影响。Handschin等报道CXCL10/肌酐比值（CXCL10/Cr）与血尿无相关性，其研究中的血尿主要为0～10个红细胞/高倍视野（RBC/HPF），仅少数样本>100 RBC/HPF（可能对应肉眼血尿），这与本研究结果一致，即轻中度血尿不影响尿液CXCL10，但肉眼血尿会导致负偏倚，故重度血尿患者应谨慎解读。脂尿在肾移植患者中除非发生肾病综合征否则不常见，但需认识到此类患者可能出现CXCL10结果正偏倚。分析前误差约占实验室总误差的60%～70%，昼夜变化、空腹状态、急性应激、运动、创伤、采集管与抗凝剂选择、样本类型、储存温度与时长及冻融循环均可影响
