《PLOS Computational Biology》：Early vs late fusion of qMIDS with machine learning based classifiers for oral cancer diagnosis from gene expression data
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定量恶性肿瘤指数诊断系统（quantitative Malignancy Index Diagnostic System，qMIDS）方法与机器学习分类器（machine learning classifiers）用于基因表达数据口腔癌诊断的不同融合架构（fu
定量恶性肿瘤指数诊断系统（quantitative Malignancy Index Diagnostic System，qMIDS）方法与机器学习分类器（machine learning classifiers）用于基因表达数据口腔癌诊断的不同融合架构（fusion architectures）被研究。所提出的融合架构在地理和民族多样化的数据集上被检验，评估结果显示晚期融合（late fusion）带来性能提升，在每一队列中，晚期融合在比反向更多的匹配模型配置上显著优于早期融合（early fusion），尽管在最佳性能配置下，两种架构在大多数队列中在统计上不可区分。数据集间分析（Inter-dataset analysis）显示，当训练/测试样本来自不同人群时，所提出的架构具有稳健性（robustness）。
**一、研究背景与问题**
口腔癌（oral cancer）中，口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）约占90%，是全球重大公共卫生问题，累及唇、舌、牙龈和颊黏膜。主要危险因素包括烟草使用、过量饮酒及HPV感染，发病率与年龄和性别相关，50岁后上升，男性为女性的2–3倍。各地区发病率差异显著，从中国每10万人1.5例到印度9.9例、英美4.5–4.6例不等。尽管治疗取得进展，总体5年生存率仍为50%，早期约90%、晚期约30%，凸显早期检测的重要性。对高危口腔潜在恶性疾患（oral potentially malignant disorder，OPMD）病变和/或早期OSCC的早期检测对改善预后、降低死亡率至关重要。当前基于组织病理学的诊断方法无法可靠预测哪些OPMD病变将进展为口腔癌。
近期研究致力于开发新型分子诊断工具。例如一项研究在241名健康志愿者和578例OSCC患者的大队列中研究血清代谢组学，机器学习（machine learning，ML）识别出与OSCC相关的独特代谢模式；另一项研究分析6个微阵列数据库并识别出预测口腔癌复发的4基因特征。但多数研究仅涉及单一验证队列，检测方法的可推广性未知。研究人员此前开展了最大的国际多队列验证研究之一，采用qMIDS方法，从1 mm微创组织活检中测量16个基因的mRNA，对来自英国、印度和中国的500余份地理和民族多样化样本进行OPMD和OSCC风险分层。qMIDS检测使用逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）测量与关键驱动癌基因FOXM1相关的16基因panel，FOXM1参与细胞增殖、分化、衰老、基因组不稳定性、表观遗传学、干细胞重编程、基质和免疫调节。FOXM1转录因子已被证明是39种癌症类型中上调最多的癌基因之一，是癌症预后不良的主要预测因子。研究人员此前研究已证明qMIDS可稳健量化OSCC中跨民族、年龄、性别和地理起源的普遍FOXM1驱动致癌程序。qMIDS检测仅需微小组织样本（1 mm），与传统手术活检通常需提取>5–10 mm组织且对不能耐受局部注射的患者可能需全身麻醉形成鲜明对比。这种微创方法不仅减少患者不适，还显著缩短从活检到结果的时间——90分钟内提供分子信息，而组织病理学需一周以上。小样本量使快速穿刺活检成为可能，并允许对广泛口腔野改变患者进行多位点采样，降低误诊风险。虽然仍具侵入性，但组织活检比液体活检（如唾液或血液）提供更部位特异和可靠的标本形式，后者常敏感性差且无法定位病变。最终，基于组织的诊断对确认恶性和指导手术干预仍必不可少。
当前qMIDS方法依赖在有限数据集上训练的静态算法，可能降低其在此前未研究人群中诊断性能。为解决此局限，整合ML对提高跨多样人口群体的适应性、可推广性和诊断效率至关重要。因此本文研究qMIDS方法与ML分类器的融合用于口腔癌诊断，利用已从多队列整理的基因表达数据，开发更准确、稳健和人群包容的诊断模型。
**二、主要关键技术方法**
研究人员使用来自英国、印度（含北印度IN-N和南印度IN-S两个子集）和中国的四个口腔癌数据集（队列样本量33–309例），每个样本包含经RT-qPCR测量的14个靶基因（HOXA7、CENPA、NEK2、DNMT1、INHBA、FOXM1、TOP2A、BIRC5、MMP13、CXCL8、NR3C1、IVL、CBX7和S100A16）相对定量信息及以两个内参基因（YAP1和POLR2A）平均循环阈值（cycle threshold，Ct）表征的质量特征；采用标准化的Ct法归一化和log2变换预处理流程，未施加跨队列批次校正。qMIDS方法按算法将14个靶基因mRNA水平转换为单一恶性肿瘤指数（malignancy index，MI）。构建两种融合架构：早期融合将MI与14个基因特征拼接后经特征选择再分类；晚期融合先由基因特征训练基分类器，将其类别概率与MI拼接后训练元分类器（采用堆叠的折外预测避免信息泄漏）。比较最小冗余最大相关（minimum Redundancy Maximum Relevance，mRMR）与基于SVM的递归特征消除（SVM-RFE）两种特征选择算法，评估包括SVM（线性、RBF、多项式核）、随机森林（RF）、k近邻（kNN）、逻辑回归（LR）、AdaBoost（AB）、梯度提升（GB）、Extra Trees（ET）、线性判别分析（LDA）和XGBoost（XGB）在内的八类ML算法，超参数经嵌套分层五折交叉验证的网格搜索调优，外层采用十折交叉验证，并进行配对显著性检验、过拟合与模型稳定性评估及跨数据集分析。
**三、研究结果**
**早期融合（Early fusion）**：通过比较四个数据集上早期融合与无融合（qMIDS单独及最佳ML）的性能，得出早期融合在多数指标上表现最佳；相对无融合，F1提升从CN队列的0.52%到IN-S队列的12.56%，AUC提升从UK队列的1.6%到IN-S队列的4.63%；LR和XGB在多数数据集表现良好。
**晚期融合（Late fusion）**：通过同样比较，得出晚期融合在多数指标上表现最佳；相对无融合，F1提升从IN-N队列的1.09%到IN-S队列的10.74%，AUC提升从IN-N队列的0.64%到IN-S队列的6.8%；XGB、SVM和LR在多数数据集表现良好。早期与晚期融合比较显示晚期融合在全部/多数指标和数据集上性能更高，F1差异从IN-S队列的0.58%到CN队列的2.35%，AUC差异从IN-N队列的0.24%到IN-S队列的6.54%。
**过拟合与模型稳定性评估（Overfitting and Model Stability Assessment）**：通过十折交叉验证AUC的标准差和95%置信区间（confidence interval，CI）及学习曲线分析，得出四个队列中AUC的变异相对报告的提升幅度较窄，学习曲线随样本量增加呈收敛而非发散，与所报告增益反映真实信号而非折特异性过拟合一事相符；但鉴于样本量，尤其IN-S和CN，应视为支持性而非决定性证据，仍需独立前瞻性验证队列。
**统计显著性检验（Statistical significance testing）**：通过对每折AUC值进行配对t检验，得出达到常规显著性（p<0.05）的比较为UK队列早期融合、IN-S队列早期融合和CN队列晚期融合模型，其余比较虽有数值改善但未达显著，尤其较小队列。
**早期与晚期融合直接比较（Direct comparison of early versus late fusion）**：通过在每个队列140个匹配配置（分类器×特征选择方法×保留特征数）上进行双侧折配对t检验，得出中位AUC差异在四个队列均利于晚期融合；IN-N、IN-S和CN队列中晚期融合从未显著劣于早期融合，分别有41、80和68个配置显著优于早期融合；UK队列较均衡，39个配置显著利于晚期融合、29个显著利于早期融合。在对应最佳晚期融合模型的匹配配置下，两架构差异在IN-N（p=0.33）、IN-S（p=0.91）和CN（p=0.83）未达显著，UK队列显著利于早期融合（p<0.001）。跨数据集匹配比较（双侧bootstrap检验）显示，在1440个比较中晚期融合显著优于早期融合397次，早期融合显著优于晚期融合0次。
**数据集间分析（Inter-dataset analysis）**：通过每次用一数据集训练另一数据集测试，得出使用不同数据集训练和测试不显著影响口腔癌诊断性能；UK队列最佳跨数据集性能较单队列F1低1.17%、AUC低1.09%，IN-N分别高1.06%和0.99%，IN-S分别高2.06%和0.32%，CN分别低0.77%和1.47%；IN-N以IN-S训练时较仅用IN-N训练F1高3.64%、AUC高3.19%，IN-S以IN-N训练时较仅用IN-S训练F1低1.23%、AUC低1.88%。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出：qMIDS的MI是14个FOXM1网络基因相对健康参考分布log2倍数变化的固定闭式组合，各靶基因加性贡献并以单一阈值（MI=4）判定恶性。学习型元分类器从相同14个转录本中恢复额外判别信息，表明FOXM1驱动致癌信号并非纯加性，基因间联合携带的诊断信息超过单一线性指数所能表示。融合最大增益见于病例构成最异质且样本量最小的IN-S队列，ML层实现在不改变基因panel或其所测生物学的前提下对FOXM1特征进行重新加权和重新阈值化。融合分析的主要洞见在于单一固定分子阈值对多基因致癌程序的描述不完整，且该缺口可用现有14基因检测在统计上部分弥补，而非发现新基因。临床转化方面，现行OPMD和OSCC诊断路径依赖组织病理学，存在观察者间变异且无法可靠预测进展；任何固定诊断公式的实用约束是部署于新人群、样本处理方案或仪器时需重新推导参考分布和阈值，成本高且慢。结果表明该重新校准可通过在现有14基因检测之上应用轻量可再训练的ML层实现，无需重新设计基因panel、生化或可解释的qMIDS评分本身，后者仍可供临床医生与融合预测并列使用。跨数据集实验显示即使训练和部署人群在民族和地理上差异显著，仍可实现一定程度的适应，多数训练/测试组合性能下降一般低于2%。实践中支持单一qMIDS检测跨新临床站点部署的转化路径，仅需小规模本地采集的校准集再训练融合层而非对底层分子检测进行完整再验证；融合模型相对固定阈值基线提高IN-S（82.92%至93.33%）和CN（91.40%至94.86%）队列敏感性，可能减少假阴性误分类并支持更可靠的早期干预。跨数据集可迁移性模式方面，不同训练/测试组合的变异本身具有信息量，可能贡献因素包括：生物学和人口学相似性、组织处理兼容性及队列间技术异质性。早期融合在跨数据集设置中偶尔以原始AUC优于晚期融合，但在相同训练/测试组合的直接匹配比较中，早期融合在1440个配置中从未显著优于晚期融合；研究人员解释为早期融合允许特征选择和分类步骤学习MI评分与个体基因特征间的直接交互，在训练和测试分布不同时可产生更稳健的联合表示；晚期融合则因基分类器和元分类器在两独立优化的表示上训练，在基分类器校准随分布变化而偏移时更易受误差传播影响。晚期融合在被融合两模态尺度差异大、样本量小或某一模态在给定队列更可靠时预期占优。结果表明无任一融合架构在人群偏移下占主导，合适选择可能取决于训练与部署人群间分布偏移的程度和性质。实践中这些可迁移性结果提示qMIDS-based ML模型不应假定在新人群中均匀泛化，建议在新人群、实验室或样本处理方案部署前使用小规模本地代表性样本集进行人群特异性验证步骤，既是确认性能、必要时再训练晚期融合层的需要，也是因假阴性误分类可能延误癌症诊断而具有临床重要性的保障措施。在验证确认良好迁移时，跨人群部署似无需重新开发底层检测。更广泛地，这些发现支持区域感知验证流程的价值以及在最终目标为单一全球可部署分类器时纳入多人群训练数据。超越口腔癌的可推广性方面，qMIDS所探测的FOXM1致癌程序并非口腔特异，FOXM1是在至少39种癌症类型中最一致上调的转录因子之一并与多数癌症预后不良相关；所评估的计算架构——将机制锚定、临床可解释的分子指数与自适应ML元分类层配对——并非qMIDS或FOXM1特异，任何将多基因或多标志物检测简化为单一经验证指数的诊断检测原则上均可与类似晚期融合层配对，以获得人群水平适应性同时保留原指数的可解释性和监管记录。局限性方面：队列虽地理和民族多样但规模中等（每队列33–309例），较小的IN-S（n=33）和CN（n=35）队列限制了性能差异估计的精度，部分报告至三位有效数字的AUC改善处于置信区间内且未达统计显著，应视为初步而非结论性；嵌套交叉验证、标准差/CI报告和学习曲线分析虽未显示明显过拟合证据，但不能替代前瞻性独立采集的验证队列；队列按地理分别分析，在训练/测试划分前合并所有可用样本可能进一步提高单一分类器跨民族的可推广性；将融合架构扩展至其他FOXM1相关癌症及晚期融合qMIDS模型的前瞻性临床验证仍需进行。
结论部分译文：提出了基于基因表达数据的qMIDS方法与ML分类器用于口腔癌诊断的早期和晚期融合架构。评估在英国、印度和中国的四个数据集上进行，评估结果显示晚期融合在大多数评估指标的总体上优于其他评估设置。表现最佳的晚期融合模型为LDA（UK）、XGB（IN-N）、SVM（IN-S）和Extra Trees（CN）。相对qMIDS单独基线，这些模型在英国、IN-N、IN-S和CN队列分别将AUC提高0.47、2.83、6.07和4.40个百分点，并将F1提高1.73（IN-S）和6.29（CN）个百分点，同时在英国和IN-N队列与qMIDS单独保持0.7个百分点以内。相对相应的无融合ML基线，晚期融合将F1最多提高10.74个百分点、AUC最多提高6.8个百分点（均在IN-S队列）。使用不同数据集进行训练和测试的进一步分析显示所提出架构的稳健性，证明该方法的可迁移性，尽管在人群偏移下早期融合偶尔以原始AUC优于晚期融合，但从未显著如此，可能反映早期融合在训练和测试分布不同时学习MI评分与基因特征间直接交互的能力。除性能提升本身外，这些结果表明14基因qMIDS panel所捕获的FOXM1驱动致癌程序携带单一线性指数无法充分利用的诊断信息，且该残余信息可通过轻量、本地可再训练的ML层而非重新设计底层检测来恢复。这种"可解释指数+自适应ML层"策略可能为在新颖多样患者人群中部署qMIDS及潜在其他FOXM1驱动或单指数分子诊断提供一条减少再验证负担的实用途径。鉴于所研究部分队列规模中等，在这些架构被视为可临床部署之前，需在更大、前瞻性采集和/或合并的多民族数据集上进一步验证。
