工程化恶臭假单胞菌扩展对乙酰香草酮、5-羧基香草酸和香草酰基乙醛酸的分解代谢能力以实现硫酸盐木质素来源芳香化合物的粘康酸生产

《Metabolic Engineering》：Expanding the catabolic capacity of Pseudomonas putida to acetovanillone, 5-carboxyvanillate, and vanillyl glyoxylate for muconate production from kraft lignin-derived aromatics

　　

研究人员对一株恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）进行了菌株工程改造，使其能够将九种松木硫酸盐木质素（kraft lignin）单体转化为粘康酸（muconate）。研究人员整合了乙酰香草酮（acetovanillone）、5-羧基香草酸（5-carboxyvanillate）和香草酰基乙醛酸（vanillyl glyoxylate）的分解代谢基因。菌株KMM428将硫酸盐木质素单体库的生物转化能力扩展了37.6 mol%。在解聚的硫酸盐木质素物流中，以单体为底物时粘康酸收率达到99 mol%。

硫酸盐木质素（kraft lignin）是制浆造纸工业产生的大宗副产物，其高度缩合的结构中含有大量难以断裂的碳-碳（C–C）键，而传统解聚方法主要针对碳-氧（C–O）键断裂，长期限制了该底物的利用价值。针对木质素衍生芳香化合物组成复杂、异质性强的问题，微生物通过共同中间代谢途径将多种芳香单体汇聚转化为单一产物的"生物漏斗（biological funneling）"策略已在多种异质原料中得到验证。前期研究中，研究人员采用铜（Cu）催化的氧化解聚实现了松木和杨木来源还原催化分馏（RCF）木质素油中C–C连接低聚物的断裂，并利用工程化恶臭假单胞菌KT2440将松木来源芳香单体转化为粘康酸或2-吡喃酮-4,6-二羧酸。然而，该菌株无法利用乙酰香草酮以及由β-5键断裂产生的5-羧基香草酸、5-羧基香草醛和5-甲酰基香草醛，导致21 wt%的芳香单体未被利用。虽然乙酰香草酮和5-羧基香草酸在其他芳香降解细菌中的代谢已有报道，但这两条途径尚未在恶臭假单胞菌KT2440中评估或组合。基于此，研究人员以松木硫酸盐木质素为底物，采用铜催化氧化解聚结合逆流萃取获得芳香单体混合物，并通过代谢工程扩展宿主菌的分解代谢谱，构建了能够将解聚硫酸盐木质素中全部九种已鉴定芳香单体转化为粘康酸的单一菌株KMM428。该研究将这一过程的碳生物转化能力扩展了37.6 ± 0.1 mol%，在氧化木质素物流中实现了99 ± 3 mol%的粘康酸收率，将碳转化范围拓展至以往仅针对部分化合物的研究之外，对推动木质素生物 valorization 具有重要价值。

在技术方法层面，研究人员采用定制的连续段塞流反应器（slug-flow reactor）在210 °C、311 psi条件下以CuSO₄·5H₂O为催化剂对松木硫酸盐木质素进行氧化解聚，反应液经酸化、逆流萃取和旋转蒸发获得氧化木质素；采用超高效液相色谱-二极管阵列检测（UHPLC-DAD）和凝胶渗透色谱（GPC）对解聚产物进行定量与分子量表征；通过同源重组和无标记基因整合将密码子优化后的异源基因以合成操纵子形式整合至染色体，并利用丝氨酸重组酶辅助基因组工程（SAGE）构建测试菌株；在微孔板和摇瓶中以M9基本培养基进行生长与转化实验，并结合补料分批葡萄糖供给评估粘康酸生产。

研究结果方面：第一，松木硫酸盐木质素的芳香单体生成。铜催化氧化使木质素分子量显著下降，单体收率为4.5 wt%（以木质素计），氧化木质素中定量单体占总质量17 wt%，其中香草醛占45 mol%、5-羧基香草醛13 mol%、香草酸8 mol%、乙酰香草酮8 mol%、5-羧基香草酸8 mol%、5-甲酰基香草醛5 mol%、4-羟基苯甲醛5 mol%、香草酰基乙醛酸5 mol%、4-羟基苯甲酸2 mol%。第二，acv和vce途径的异源表达使菌株在补充碳源和能源条件下利用乙酰香草酮。研究人员将来自Sphingobium lignivorans SYK-6的acvABCDEF和vceAB八个基因分配至三个由tac启动子驱动的合成操纵子并整合至染色体，获得菌株KMM022；该菌株不能以乙酰香草酮或乙酰丁香酮为唯一碳源生长，但在香草酸共供给条件下48 h内可完全利用二者；当乙酰香草酮与香草酸比例提高至约1:1时，72 h仅利用50 ± 5 mol%的乙酰香草酮；过表达vanAB并缺失crc（菌株KMM091）或以marK^E16K替换acvAB（菌株MG084）均未能实现以乙酰香草酮为唯一碳源生长，而补充碳源种类影响不大，提示能量或氧化还原限制而非天然基因激活不足。第三，ligW2过表达使菌株利用5-羧基香草酸、5-羧基香草醛和5-甲酰基香草醛。在crc位点整合ligW2获得菌株MG079，该菌株可以5-羧基香草酸和5-羧基香草醛为唯一碳源生长，但生长速率较天然底物低两个数量级；5-甲酰基香草醛单独供给时72 h仅转化21 ± 2 mol%，而在模拟氧化木质素组成的混合物中36 h内被完全消耗，表明ligW2过表达结合天然醛脱氢酶活性足以完成上述三种化合物向香草酸的转化。第四，表达苯基乙醛酸脱羧酶的菌株在香草酸存在下消耗香草酰基乙醛酸。研究人员测试了三种硫胺素焦磷酸（TPP）依赖型苯基乙醛酸脱羧酶同源物，菌株KMM326（表达来自恶臭假单胞菌的mdlC）、KMM328（表达来自Pseudomonas stutzeri ST-201的dpgB）和KMM330（表达来自Acinetobacter calcoaceticus的EC844_1132）在5 mM香草酰基乙醛酸与5 mM香草酸共供给时分别消耗1.6 ± 0.1、1.6 ± 0.3和1.1 ± 0.2 mM底物，显著高于对照菌株AG5577的0.11 ± 0.02 mM；摇瓶条件下KMM326和KMM328在72 h内分别消耗56 ± 1 mol%和50 ± 2 mol%的香草酰基乙醛酸，且香草酸在12 h内被耗尽。第五，SYK-6乙酰香草酮途径、LigW2和MdlC的表达赋予菌株从乙酰香草酮、5-羧基香草酸、5-羧基香草醛、5-甲酰基香草醛和香草酰基乙醛酸生产粘康酸的能力。研究人员在CJ781衍生物中组合上述途径并叠加catA2过表达、aroY强RBS驱动、EcdBD辅助蛋白及PP_3493（P133L）突变，构建菌株MG080和KMM428；MG080可将八种单体转化为粘康酸，其中5-羧基香草醛和5-甲酰基香草醛的粘康酸收率分别为82 ± 8 mol%和90 ± 4 mol%，其余底物为定量收率，在模拟混合物中实现100 mol%单体利用和定量粘康酸收率；KMM428额外整合mdlC后，对1 mM香草酰基乙醛酸的消耗率达94.0 ± 5.2 mol%，粘康酸收率89.9 ± 0.4 mol%。第六，KMM428可同时将硫酸盐木质素来源的九种单体近乎定量转化为粘康酸。在约5 mM总芳香单体补料分批摇瓶培养中，KMM428于48 h内将模拟混合物中全部单体转化，粘康酸收率97 ± 1 mol%；72 h内利用氧化木质素中93.6 ± 0.2 mol%的定量单体，残余成分为乙酰香草酮（剩余18 ± 2 mol%）、5-甲酰基香草醛（剩余38 ± 1 mol%）和香草酰基乙醛酸（剩余36 ± 4 mol%），粘康酸收率达99 ± 3 mol%，提示样品中未定量化合物亦被转化为粘康酸；模拟混合物与氧化木质素之间菌株表现的差异可能源于氧化木质素中其他化合物对细胞的毒性，这与单体纯度仅17 wt%相一致。

讨论部分指出，本研究证明铜催化氧化解聚可从松木硫酸盐木质素生成生物可利用的芳香单体，并可由工程化恶臭假单胞菌KT2440高效转化为粘康酸。菌株KMM428是单一工程菌株，能够从全部九种已鉴定芳香单体生产粘康酸，将该过程的生物转化能力扩展37.6 ± 0.1 mol%，并在氧化木质素物流中实现99 ± 3 mol%的粘康酸收率。与平行研究中工程化Rhodococcus aromaticivorans RHA1的工作相比，KMM428在分批培养中未受原儿茶酸（protocatechuate）积累限制，而是受乙酰香草酮、5-甲酰基香草醛和香草酰基乙醛酸转化缓慢的限制，补料分批策略可能克服该限制；两种菌株虽在摇瓶中均达到近理论收率，仍需生物反应器研究评估放大性能及真实木质素底物条件下的表现。未来菌株工程靶点包括：通过生物勘探寻找活性更高的酶和转运蛋白、适应性实验室进化、动态调控策略；针对乙酰香草酮可优化GD02来源hpe途径的表达或组合SYK-6、GD02和A. macra来源基因；针对5-甲酰基香草醛可通过随机条形码转座子插入测序或CRISPR干扰筛选鉴定活性醛脱氢酶并过表达或改造；针对香草酰基乙醛酸需进一步研究其他苯基乙醛酸脱羧酶同源物及硫胺素焦磷酸可用性的影响。此外，解聚木质素物流中芳香单体收率低、浓度稀释及纯度低等过程层面限制仍需通过整合离心分配色谱和膜过滤等纯化方法与生物转化来加以解决。研究结论为：铜催化氧化解聚能够从松木硫酸盐木质素产生生物可利用的芳香单体，工程化恶臭假单胞菌KT2440菌株KMM428可将解聚硫酸盐木质素物流中全部九种已鉴定芳香单体近乎定量地转化为粘康酸，将该生物转化过程的碳利用范围扩展37.6 ± 0.1 mol%，并在氧化木质素物流中实现99 ± 3 mol%的粘康酸收率，表明恶臭假单胞菌KT2440可被工程化改造以近理论收率将解聚硫酸盐木质素中的定量芳香单体转化为粘康酸。