《Briefings in Functional Genomics》：KaryoExplorer: an automated digital karyotyping pipeline with interactive visualizations
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常规基因组质量控制（QC）对于确保用于疾病建模、再生医学及相关细胞系应用的诱导多能干细胞（iPSC）的完整性至关重要。然而，基于单核苷酸多态性（SNP）基因分型芯片的数字核型分析工作流程往往呈碎片化，需要分别使用不同工具进行拷贝数变异（CNV）检测、杂合性缺失
常规基因组质量控制（QC）对于确保用于疾病建模、再生医学及相关细胞系应用的诱导多能干细胞（iPSC）的完整性至关重要。然而，基于单核苷酸多态性（SNP）基因分型芯片的数字核型分析工作流程往往呈碎片化，需要分别使用不同工具进行拷贝数变异（CNV）检测、杂合性缺失（LOH）分析和结果可视化。这种碎片化使解读复杂化、限制了可重复性，并给常规使用和协作审查带来了实际障碍。本研究提出KaryoExplorer，一个基于Nextflow的自动化流程，用于基因分型阵列数据的数字核型分析，可生成易于使用、自包含的交互式HTML报告。CNV判定与基于纯合性片段（ROH）的候选拷贝中性杂合性缺失（cnLOH）区域检测被整合到一个统一、可重复的工作流程中。所生成的浏览器端报告整合了全基因组核型图、染色体水平B等位基因频率（BAF）、log-R比值（LRR）、拷贝数（CN）轨道、QC汇总、事件表以及同步的交互式视图，支持从样本概览到信号水平检查的直观导航。在一个36样本基因分型数据集上以单样本和配对分析两种模式进行验证，结果显示缺失事件（CN≤1）与ROH片段重叠的中位数为99.2%，支持了整合策略的生物学一致性。由ROH与二倍体拷贝数状态（CN=2）重叠所定义的候选cnLOH区域，相对于二倍体非ROH区域表现出增加的BAF偏离，并在配对技术重复间高度可重复。因此，KaryoExplorer通过将自动化分析与可及、交互且可共享的报告相结合，简化了基因组QC工作流程中的数字核型分析。
**研究背景与问题** 基因组完整性的维持是细胞生物学、再生医学和大规模生物样本库等领域的根本要求。培养细胞系和工程化生物模型在长期培养或实验操作过程中易获得基因组改变，如拷贝数变异（CNV）和染色体不稳定性，这些异常会影响研究结果的可重复性和潜在治疗应用的安全性。常规基因组筛查长期依赖G显带等传统核型分析方法，但其分辨率和效率难以满足现代高通量应用需求。数字核型分析利用SNP基因分型芯片检测光学显微镜不可见的基因组变化，依赖两个主要信号：反映信号强度以揭示增益和缺失的log-R比值（LRR），以及捕捉等位基因平衡以识别杂合性缺失（LOH）的B等位基因频率（BAF）。二者联合可检测缺失、重复以及拷贝中性杂合性缺失（cnLOH）。尽管底层算法成熟，但实际工作流程碎片化：研究人员常用不同工具分别进行CNV和ROH/LOH计算，需人工验证和检查，妨碍QC效率、结果共享和可重复性。现有工具如PennCNV和QuantiSNP主要针对单样本独立分析，缺乏任意配对比较的原生支持，cnLOH系统注释与协同可视化并非其输出重点；商业GUI工具虽提供核型图和染色体BAF/LRR图，但为专有、平台依赖且难以整合进可重复流程。因此研究人员开发KaryoExplorer以弥合这一空白。
**关键技术方法** 该流程以Nextflow DSL2（v24.10.4）实现并通过容器化环境（Docker、Apptainer/Singularity）分发；接受Illumina GenomeStudio导出文件及芯片manifest和参考基因组，兼容Illumina Infinium GSA v3.0和v4.0；使用bcftools cnv（v1.20）基于隐马尔可夫模型（HMM）从BAF和LRR联合信号推断拷贝数状态；使用bcftools roh（v1.20）检测纯合性片段；利用BEDTools（v2.30.0）进行CNV与ROH区间交集分层；报告生成由Python（v3.12）后处理模块和Bokeh库（v3.3.4）实现。验证数据为36样本基因分型数据集，含六对技术重复，数据来源为Illumina 2024 Infinium GSA v4.0（经Illumina公司授权使用）。
**研究结果**
*流程执行与输出*：KaryoExplorer支持单样本和配对（PRE→POST）两种分析模式，共享QC和输入准备阶段后分流，最终均生成交互式HTML报告。通过对三种可视化库的基准测试，Bokeh生成的输出最小（约11 MB，约599k数据点跨20条染色体），约为Plotly的1/10、mpld3的1/46，且运行时间最短，据此选定Bokeh。
*CNV–ROH重叠及候选cnLOH区域验证*：将CNV限定为拷贝丢失事件（CN≤1）时，ROH覆盖的CNV长度中位数为99.2%，表明几乎所有判定缺失长度均与ROH相交，可作为交集机制的正对照；在含中性阈值（CN≤2）下该指标降至21.8%。反之，CNV覆盖的ROH长度中位数从CN≤1时的16.1%升至CN≤2时的97.3%，表明大部分ROH长度位于二倍体拷贝数区域。逐样本比较候选cnLOH（ROH∩CN=2）与对照CN=2无ROH区域的BAF偏离0.5的均值，全部36个样本中候选区域均更高（单侧配对Wilcoxon符号秩检验，P=1.46×10
?11，Δmean=+0.073，n=36），候选区域逐样本均值中位数为0.487、对照为0.414。配对技术重复间ROH片段Jaccard指数中位数为0.990，候选cnLOH区域为0.977，支持该框架在重复测量间的稳定性。
*交互式报告结构与导航*：报告分为四个页面级部分，通过持久导航菜单访问。首页展示分析模式、项目详情、可展开的分析参数、配对模式的QC汇总表及个体样本QC指标，并对每对PRE–POST执行身份同源分析报告π^值以核验样本一致性。样本汇总页提供全基因组视图，包括元数据、CNV统计表、染色体水平CNV分布条形图及核型图，配对模式默认显示差异分析结果并可展开个体核型图。染色体页面以碱基级分辨率展示BAF、LRR和CN三个轨道的主面板，ROH、拷贝丢失LOH和候选cnLOH区间以不同颜色叠加标示，配对模式下九个图（三轨道×三视图）完全同步，支持平移、缩放和范围选择的联动。悬停提示显示事件标签、基因组坐标、长度、P值及差异模式下的拷贝数变化，页面支持保存/打印PDF并可将单个图导出为PNG。
**讨论与结论** 讨论部分指出，KaryoExplorer结合了命令行CNV判定工具的分析深度与专有GUI平台的丰富可视化，同时克服了二者在可视化、配对分析支持、可重复性和自动化方面的局限，实现了从原始GenomeStudio导出到可共享浏览器端产物的端到端自动化。选择Bokeh经基准测试确定，其效率支持数据直接嵌入并在浏览器中快速渲染，自包含格式无需外部查看器或服务器基础设施。cnLOH检测策略被有意设计为发现与优先级排序层而非诊断性判定工具：缺失事件与ROH的高重叠验证了交集机制可可靠恢复已知生物学现象；但并非所有CN=2+ROH区域均代表获得性cnLOH，单样本模式无法区分体细胞cnLOH事件与体质性纯合性，配对模式通过差异ROH分类器按相对供体样本的状态归类区域可减少此歧义。局限性包括：流程目前专门针对Illumina Infinium平台优化且需GenomeStudio导出文件，其他芯片厂商或原始数据格式的原生支持尚未整合；cnLOH检测作为发现与优先级排序框架而非确定性诊断工具，单样本模式无法明确区分获得性体细胞cnLOH与体质性纯合性，标记区域需专家解读及必要时额外验证。结论部分译文：KaryoExplorer为基于Illumina基因分型芯片的iPSC及其他细胞系数字核型分析提供了一个整合、可重复且开源的流程。通过在单一Nextflow工作流程中结合CNV检测、基于ROH的cnLOH识别和交互式可视化，它以一次自动化分析取代了碎片化的多工具流程。自包含HTML报告使研究人员能够直接在网页浏览器中探索全基因组核型图、同步的BAF/LRR/CN轨道和QC仪表板，有助于实现透明QC、协作审查和图片导出。该流程已容器化，在HPC集群、Linux、macOS（含Apple Silicon）和Windows上测试，并作为开源软件免费提供。
