《Current Proteomics》：A histone deacetylase-linked gene signature supports prognostic stratification and is associated with immune features in osteosarcoma
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背景：骨肉瘤（OS）是一种侵袭性恶性骨肿瘤，具有高转移风险。本研究旨在构建组蛋白去乙酰化酶（HDAC）相关预后特征，并探讨其与免疫特征及预测药物敏感性的关联。方法：以TARGET-OS的转录组与临床数据作为训练队列，GSE21257与GSE39055用于外部验
背景：骨肉瘤（OS）是一种侵袭性恶性骨肿瘤，具有高转移风险。本研究旨在构建组蛋白去乙酰化酶（HDAC）相关预后特征，并探讨其与免疫特征及预测药物敏感性的关联。方法：以TARGET-OS的转录组与临床数据作为训练队列，GSE21257与GSE39055用于外部验证。采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）与加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定HDAC相关共表达模块，并运用Cox回归构建预后特征。通过正则化回归、bootstrap重采样、重复五折交叉验证及临床Cox分析评估模型稳定性。通过计算评估免疫浸润与预测药物敏感性。在SJSA-1细胞中对PSD3进行初步验证。结果：高HDAC评分与转移及不良生存相关。由CASK、NFX1、PSD3与SAV1组成的四基因特征可在TARGET-OS与GSE21257中对总生存进行分层。重复五折交叉验证所得平均C-index为0.713，且在校正可获得的临床变量后，RiskScore仍与总生存相关（HR = 3.112，95% CI：1.866–5.190，P < 0.001）。在GSE39055中，高风险组无复发生存期更短（P = 0.03），3–5年AUC为0.71。较高的RiskScore与推断的CD8? T细胞、巨噬细胞及自然杀伤细胞浸润降低、推断的髓源性抑制细胞（MDSC）评分升高，以及15种化合物预测IC50值降低相关，上述结果在错误发现率校正后仍显著；而风险组间肿瘤免疫功能障碍与排斥（TIDE）评分无显著差异。敲低PSD3可抑制SJSA-1细胞增殖、侵袭与迁移。结论：该四基因HDAC相关特征与OS预后及免疫微环境特征相关。其稳健性及预测药物敏感性关联尚需进一步前瞻性与实验性验证。
骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是青少年最常见的恶性骨肿瘤，尽管新辅助化疗联合手术的多模式治疗改善了局限性患者的生存，但高危患者数十年来的临床进展有限，超过40%的患者初诊即存在转移或随后发生转移性复发，该高危人群的长期生存未见有意义的改善。这种停滞与染色体不稳定、基因组复杂及频发突变等复杂生物学特征相关，阻碍了有效精准治疗的发展。目前化疗的组织病理学反应仍是风险分层的主要标准，但其不能充分反映分子异质性及与免疫治疗相关的新兴治疗特征。因此，能够同时反映肿瘤内在程序与免疫微环境特征的生物标志物有望改善预后评估并支持进一步治疗探索。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）通过去除组蛋白及非组蛋白的乙酰基调控基因表达，进而影响染色质构架、转录活性及细胞周期、DNA修复、免疫激活等关键细胞过程。骨肉瘤是基因组不稳定肿瘤，以TP53和RB1频发缺失及相对较低的突变负荷为特征，表观遗传失调已被确定为转移和疾病进展的关键驱动因素。HDAC2可通过激活ATM/p53通路参与骨肉瘤DNA损伤介导的细胞死亡；entinostat/Syndax 275、PXD-101等HDAC抑制剂可通过诱导细胞周期阻滞和凋亡抑制OS生长；其他HDAC抑制剂还可通过调节髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的扩增与功能影响肿瘤免疫微环境。基于上述背景，研究人员整合批量RNA-seq数据与统计建模，构建骨肉瘤HDAC相关预后特征，鉴定出源自HDAC相关共表达网络的四基因特征，并分析其与预后、免疫浸润、TIDE相关特征及计算预测药物敏感性的关联，同时以PSD3为代表风险相关基因开展初步体外实验。
研究人员开展研究采用的主要关键技术方法包括：以TARGET-OS的84例肿瘤样本（FPKM格式转换为log2(FPKM + 1)）为训练队列，GSE21257（53例肿瘤样本，含临床随访）和GSE39055（36例骨肉瘤病例，含基因表达与无复发生存数据）为独立外部验证队列，两套GEO数据处理后的表达矩阵分别分析，未与TARGET-OS合并，外部验证时直接应用TARGET-OS所得固定回归系数而不重新筛选基因或拟合系数；采用ssGSEA计算HDAC评分（基于既往研究获得的73个HDAC相关基因集），采用WGCNA鉴定HDAC相关共表达模块；采用Cox回归构建风险模型；采用LASSO-Cox与Elastic Net Cox回归、bootstrap重采样、重复五折交叉验证及临床Cox分析评估模型稳健性；采用GSVA、ESTIMATE、MCP-counter进行免疫浸润分析，采用TIDE框架评估免疫治疗相关特征，采用oncoPredict评估预测药物敏感性；并在SJSA-1细胞中通过qRT-PCR、CCK-8、Transwell及伤口愈合实验对PSD3进行初步验证。
结果方面，高HDAC评分与转移及不良生存相关：按中位数分层显示高HDAC组转移病例比例显著更高，按最佳截断值分组后Kaplan–Meier分析显示高HDAC评分患者生存显著更差。WGCNA鉴定出两个HDAC相关基因模块：以β = 5进行样本聚类与共表达模块检测，合并后识别25个共表达模块，模块-性状分析显示白色模块（r = 0.54，FDR = 1.79 × 10-6）与品红色模块（r = 0.45，FDR = 1.23 × 10-4）与HDAC评分正相关最强，分别含137和3,173个基因；两模块内模块隶属度与基因显著性正相关，按|MM| > 0.5且|GS| > 0.3阈值获得516个核心基因，四个最终特征基因均归属品红色模块并满足阈值。核心HDAC相关基因的功能富集分析显示，KEGG通路涉及癌症中的蛋白聚糖、RNA转运、细胞周期及ErbB信号通路；GO生物学过程涉及RNA剪接、组蛋白与染色质修饰、mRNA代谢调控、肽基-赖氨酸修饰及G2/M细胞周期转换，细胞组分涉及核斑、中心体、染色质、泛素连接酶复合物、核基质、有丝分裂纺锤体极及DNA修复复合物，分子功能涉及转录辅调节与辅激活活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、组蛋白结合、修饰依赖性蛋白结合、甲基化组蛋白结合及乙酰化依赖性蛋白结合。基于四基因模型的风险分层显示，单因素Cox回归鉴定12个与总生存相关的核心基因（P < 0.05），逐步多因素Cox回归确定CASK、NFX1、PSD3和SAV1四个预后基因并构建模型RiskScore = ?1.502×CASK + 0.699×NFX1 + 0.654×PSD3 + 0.652×SAV1；TARGET-OS训练队列中高风险组生存更差，时间依赖ROC显示判别性能，主成分分析显示两风险组分离；GSE21257中较高RiskScore患者生存亦更差。四基因模型的稳健性、校正临床关联及外部验证显示，重复正则化分析中CASK、NFX1和PSD3选择稳定性较高而SAV1在更严格设置下选择频率较低，bootstrap重采样显示CASK系数保持负值而NFX1、PSD3和SAV1系数保持正值，原始系数位于其bootstrap分布中心附近，重复五折交叉验证平均C-index为0.713；包含全部84例患者与29个死亡事件的主要多因素Cox模型中，年龄（每增加5岁HR = 1.543，95% CI：1.031–2.310，P = 0.035）、转移性疾病（HR = 4.026，95% CI：1.804–8.987，P < 0.001）、肿瘤部位（其他 vs 腿/足：HR = 4.266，95% CI：1.296–14.048，P = 0.017）及标准化RiskScore（每增加1-SD HR = 3.112，95% CI：1.866–5.190，P < 0.001）与总生存相关，性别无统计学意义；比例风险假设未显著违反，年龄与RiskScore无显著非线性，方差膨胀因子为1.107–1.418提示无明显多重共线性；仅在35例有组织学反应数据的患者中进行的探索性完整病例分析显示不良组织学反应HR为18.732（95% CI：2.233–157.123，P = 0.007）、标准化RiskScore HR为3.928（95% CI：1.442–10.700，P = 0.007），但因事件数有限且置信区间极宽被认为不稳定；GSE39055中高风险组无复发生存显著更短（P = 0.03），1、2、3、4、5年AUC分别为0.36、0.60、0.71、0.71、0.71。较高RiskScore与推断的免疫及基质浸润降低相关：高风险组StromalScore（FDR = 0.010）、ImmuneScore（FDR = 0.036）和ESTIMATEScore（FDR = 0.011）显著更低；MCP-counter分析显示FDR校正后RiskScore与T细胞、CD8 T细胞、细胞毒性淋巴细胞、单核细胞系细胞、髓系树突状细胞、中性粒细胞及成纤维细胞显著负相关；ssGSEA定量的28种免疫细胞中，RiskScore与巨噬细胞、CD56dim自然杀伤细胞及中枢记忆CD4? T细胞显著负相关。RiskScore与免疫治疗相关特征及预测药物敏感性的关联显示，TARGET-OS中TIDE（FDR = 0.198）、Exclusion（FDR = 0.391）和TAM.M2（FDR = 0.514）评分在风险组间无显著差异，而高风险组Dysfunction评分更低（FDR = 0.010）、MDSC评分更高（FDR = 0.025）、CAF评分更低（FDR = 0.010）；Pearson相关分析显示FDR校正后RiskScore与15种化合物预测IC50值显著负相关，包括UMI-77_1939、MIM1_1996、Vorinostat_1012、NVP-ADW742_1932、PCI-34051_1621、AZD5153_1706、Linsitinib_1510、Talazoparib_1259、Daporinad_1248、VE-822_1613、WEHI-539_1997、VX-11e_2096、Mirin_1048、PFI3_1620和OTX015_1626，提示较高RiskScore与较低计算预测IC50值相关，尚需实验验证。PSD3敲低抑制SJSA-1细胞增殖、侵袭与迁移：与hFOB 1.19细胞相比，SJSA-1细胞中NFX1、SAV1和PSD3显著上调，CASK在两细胞类型间亦显示显著表达差异；因PSD3在预后模型中系数为正且在SJSA-1细胞中上调，被选为代表风险相关基因进行初步功能评估；siRNA介导的PSD3敲低在CCK-8实验中有效抑制SJSA-1细胞增殖，Transwell实验显示沉默PSD3明显降低其侵袭能力，伤口愈合实验显示显著损害其迁移能力。
讨论部分指出，尽管表观遗传失调在骨肉瘤中日益受到关注，但HDAC相关转录模式、临床结局、免疫特征与治疗易感性之间的关系仍不完全清楚。本研究中较高HDAC评分与转移和较差生存相关，WGCNA鉴定的HDAC评分相关模块富集于细胞周期、RNA调控和染色质相关过程，四基因特征在两个回顾性队列中实现预后分层，较高RiskScore还与多种免疫细胞浸润减少、推断MDSC评分升高及部分化合物预测IC50值降低相关，这些发现应被视为产生假设的关联。正则化、bootstrap和交叉验证分析提示四基因模型系数方向与总体判别在重采样下具有合理稳定性，临床Cox模型支持校正可得临床变量后RiskScore与总生存的关联，GSE39055中模型可区分无复发生存且3–5年AUC达0.71；但SAV1在更严格正则化下选择频率较低、GSE39055的1年AUC仅0.36且该外部队列较小并采用无复发生存而非总生存，因此这些发现强化但未确立模型的稳健性或临床可推广性。高HDAC评分与转移性疾病的关联与HDAC通过调节染色质结构、上皮-间质转化和侵袭促进肿瘤侵袭性的既有作用一致，GO分析显示HDAC相关模块集中于G2/M转换和有丝分裂纺锤体组织，与HDAC通过去乙酰化p53、α-微管蛋白和Hsp90等非组蛋白底物调控细胞周期检查点的证据一致。四个特征基因的系数和生物学解释需特别谨慎：CASK的负系数提示模型内的保护性预后关联，但其在细胞极性和黏附中的已知作用不能界定其在骨肉瘤中的功能；NFX1具有异构体和情境依赖性功能，其正系数不能解释为其通常描述的转录抑制活性具有一致的促肿瘤作用；PSD3在不同癌症中具有情境依赖性效应，与这种情境依赖一致，PSD3敲低在SJSA-1细胞中抑制恶性表型，提示其在该骨肉瘤细胞模型中具有促肿瘤作用，但潜在机制仍不清楚；SAV1是限制YAP相关增殖的经典Hippo通路组分，其正系数可能反映条件性预后关联、共表达结构或代偿反应而非直接致癌效应，因此回归系数描述的是所分析队列中的多变量关联，不应等同于单个基因普遍性的细胞自主功能。此外，近期研究为表观遗传调控、凋亡与抗肿瘤免疫之间的关系提供了更广泛背景，如萝卜硫素可诱导HEp-2癌细胞凋亡相关分子改变，二甲双胍被描述为可能影响癌症中NK和NKT细胞反应的免疫代谢调节剂，这些研究虽在其他肿瘤类型中进行，但提供了相关概念背景。较高RiskScore与多种免疫和基质细胞群体推断浸润降低及StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore降低相关，与既往免疫基因组学证据指示骨肉瘤免疫浸润有限且异质一致；FDR校正后高风险组MDSC评分更高但Dysfunction和CAF评分更低，而TIDE、Exclusion和TAM.M2在两组间无显著差异，这些发现并不必然矛盾，因为所评估的计算评分反映肿瘤免疫微环境的不同组分，但当前批量转录组关联不能确立HDAC活性与免疫抑制之间的因果关系，也不支持确定性的免疫治疗反应分层。RiskScore与15种化合物计算预测IC50值负相关，包括vorinostat和AZD5153，这些结果识别的是候选药物反应假设而非已证实的治疗敏感性，需在骨肉瘤细胞系、患者来源模型和前瞻性临床队列中验证后方可用于指导治疗选择。研究局限性包括：所有数据集均为小型回顾性公共队列且缺乏前瞻性多中心验证，TARGET-OS与两个GEO队列使用不同转录组平台并分别处理，表达尺度和动态范围的残余差异可能影响RiskScore校准，当前外部评估主要支持队列内预后分层而非绝对RiskScore值的直接跨平台可比性，主要Cox模型仅基于29个死亡事件，探索性组织学反应分析仅含35例患者和10个死亡事件且置信区间极宽提示估计不稳定和过拟合风险；73个HDAC相关基因集最初源自结肠癌研究且未在骨肉瘤中专门验证，HDAC评分应解释为探索性指标而非骨肉瘤特异性验证特征；批量转录组数据不能区分肿瘤细胞特异性与免疫细胞特异性表达模式，也不能解析异构体特异性效应；品红色模块较大、SAV1在更严格正则化下选择频率较低以及GSE39055中1年判别有限提示尽管增加了LASSO/Elastic Net、bootstrap和交叉验证分析仍存在残余模型不稳定性；功能实验仅限于单一骨肉瘤细胞系中的PSD3，CASK、NFX1和SAV1的生物学作用及HDAC相关模式与免疫特征之间的因果联系仍未验证；药物敏感性发现完全来自计算预测且未经实验证实。
研究结论译为：总之，HDAC相关四基因特征与骨肉瘤的预后及免疫微环境特征相关。PSD3敲低提供了其在SJSA-1细胞中具有情境依赖性促肿瘤作用的初步证据。免疫与药物敏感性发现仍属关联性和假设生成性，需要进一步的机制、实验和前瞻性临床验证。所增加的重采样分析、临床Cox模型和GSE39055验证提供了支持性但非决定性的稳健性证据，特别是由于外部终点为无复发生存且所有队列规模仍然有限。
