莪术醇通过阻断Jak2/Stat3信号通路抑制肝细胞癌干样细胞的上皮-间质转化

《Current Proteomics》：Curcumol inhibits epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma stem-like cells by blocking the Jak2/Stat3 pathway

　　

背景：肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一。癌症干样细胞（cancer stem-like cells, CSLCs）部分通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）促进HCC转移与复发。本研究旨在探讨莪术醇（curcumol）——莪术（Rhizoma Curcumae）中的一种活性化合物——是否通过抑制EMT及Jak2/Stat3信号轴来抑制肝细胞癌干样细胞（hepatocellular carcinoma stem-like cells, HCSLCs）。 方法：采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）表征莪术的化学成分。通过无血清球状培养结合基于EpCAM的免疫磁珠阳性分选富集HCSLCs。采用CCK-8、划痕愈合及Transwell实验评估细胞活力、迁移与侵袭能力。运用蛋白质印迹法（Western blot, WB）检测EMT及Jak2/Stat3相关蛋白表达与磷酸化水平。基于串联质谱标签（TMT）的磷酸化蛋白质组学分析磷酸化修饰图谱；采用裸鼠异种移植模型进行体内验证，莪术醇以50 mg/kg和100 mg/kg剂量口服给药。 结果：莪术醇对HCSLCs呈现浓度依赖性细胞毒性，其中HepG2-EpCAM细胞敏感性最高。Transwell实验显示，随莪术醇浓度升高，HepG2-EpCAM细胞的迁移与侵袭数量减少。裸鼠异种移植实验中，莪术醇处理组呈现剂量依赖性肿瘤生长抑制。与溶剂对照组相比，高剂量莪术醇组肿瘤体积更小，肿瘤细胞凋亡增加；TUNEL染色检测到凋亡差异具有统计学意义（P<0.05）。蛋白质印迹结果表明，莪术醇上调上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin），下调间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin），并降低HepG2-EpCAM细胞中Jak2和Stat3的磷酸化水平。磷酸化蛋白质组学分析鉴定出莪术醇处理后889个上调及248个下调磷酸化位点；这些差异修饰位点共对应365个非冗余磷酸化蛋白。在总蛋白丰度层面，定量到633个上调及177个下调蛋白。 结论：莪术醇通过阻断Jak2/Stat3信号通路抑制EMT，从而抑制HCSLCs的恶性表型。这些发现为莪术醇在靶向肝癌干样细胞的HCC治疗中的潜在应用提供了实验证据。

莪术醇通过阻断Jak2/Stat3信号通路抑制肝细胞癌干样细胞上皮-间质转化的研究解读

一、研究背景与科学问题

肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，在癌症相关死亡原因中位列第三，尤其在亚洲人群中负担沉重。慢性乙型或丙型肝炎病毒感染、饮酒、糖尿病及非酒精性脂肪性肝炎是HCC的主要危险因素。由于多数患者确诊时已处于晚期，加之治疗后预后不佳，HCC的治疗面临巨大挑战。传统治疗手段如肝切除或肝移植主要适用于早期患者，而晚期患者常采用阿霉素、紫杉醇或顺铂等化疗或放疗方案，但这些方案伴随显著副作用，包括转移和耐药问题。

2001年Reya等人首次提出癌症干细胞（CSC）概念，将肿瘤干细胞定义为恶性肿瘤组织内具有自我更新和多向分化潜能的细胞亚群。CSCs凭借其强大的增殖和转移潜能，导致肿瘤持续存在和复发，这一理论部分解释了肿瘤易转移和复发的原因，使CSCs逐渐成为癌症治疗研究的焦点。通过靶向CSCs抑制上皮-间质转化（EMT）——一种使肿瘤细胞进入血液的生物学过程——已成为有前景的治疗策略。Jak2/Stat3信号通路通过上调EMT诱导转录因子（如Snail、Zeb1、JUNB和Twist-1）并增强细胞运动能力来促进转移。

中医药在肝病治疗中已有数千年应用历史。基于定量草药的组合，中医药能够影响多个分子靶点和信号通路且副作用较小。近年来，中医药逐渐引起越来越多研究者的兴趣。新兴研究表明中医药具有显著抗癌效果，并能有效补充化疗。因此，提取单一活性成分以阐明其特异性生物学功能和分子靶点的研究日益受到重视。

莪术醇是莪术（R. Curcumae）的核心生物活性成分，具有抗肿瘤、抗增殖、抗炎和抗氧化特性。已有研究显示莪术醇可通过调控TGF-β1介导通路中的E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白诱导鼻咽癌EMT停滞；还可通过DNMT和HDAC调节抑制绒毛膜癌干样细胞，并通过抑制PI3K/AKT通路触发HepG2细胞凋亡。Zhang等人研究表明莪术醇可调节HCC中的Jak/Stat通路并逆转索拉非尼耐药。然而，莪术醇详细的分子靶点和信号机制仍未阐明。基于生物信息学和药理学的快速发展，本研究旨在探索莪术醇是否通过抑制EMT来抑制HCSLCs，并重点关注Jak2/Stat3信号通路在CSC干性和转移中的关键作用。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）表征莪术甲醇提取物的化学成分。通过EpCAM免疫磁珠阳性分选结合无血清肿瘤球培养，从Huh7、HepG2和HCCLM3三种人肝癌细胞系中富集HCSLCs。采用CCK-8实验评估细胞活力，划痕愈合实验和Transwell实验分别检测细胞迁移和侵袭能力。运用蛋白质印迹法（WB）检测EMT相关蛋白（E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白）及Jak2/Stat3通路蛋白的表达和磷酸化水平。采用基于串联质谱标签（TMT）的磷酸化蛋白质组学技术进行磷酸化修饰谱分析。体内实验采用裸鼠皮下异种移植模型，莪术醇以50 mg/kg（低剂量）和100 mg/kg（高剂量）口服灌胃给药，每日两次，实验周期28天。动物实验经广西中医药大学动物伦理委员会批准（批准号：DW20230324-116），所有动物方案严格遵守ARRIVE指南和3R原则。

三、研究结果

3.1 莪术（R. curcumae）成分分析**：通过UPLC-MS/MS鉴定出莪术甲醇提取物中16种代表性成分，主要峰对应莪术酮（curcolone）、表莪术烯醇（epicurcumenol）、莪术醇（curcumol）和前莪术二醇（procurcumadiol），多在正离子模式下检出。

3.2 HCC细胞系中HCSLCs的鉴定：采用EpCAM免疫磁珠阳性分选从Huh7、HepG2和HCCLM3细胞系中筛选HCSLCs，所选细胞在无血清培养基中形成肿瘤球，且EpCAM阳性细胞中干性相关基因表达水平更高。

3.3 莪术醇体外抑制HCSLCs活力和恶性表型：CCK-8实验显示莪术醇对HepG2-EpCAM、Huh7-EpCAM和HCCLM3-EpCAM细胞均呈现浓度依赖性抑制作用，其中对HepG2-EpCAM细胞效果最佳。划痕愈合实验和Transwell实验表明，经60 μM和90 μM莪术醇处理后，HepG2-EpCAM细胞的迁移和侵袭能力均呈浓度依赖性显著降低。

3.4 莪术醇体内抑制HCSLCs：将HepG2-EpCAM细胞皮下注射至裸鼠背部，分为对照组（玉米油）、低剂量莪术醇组（50 mg/kg）和高剂量莪术醇组（100 mg/kg）。治疗三周后，随莪术醇剂量增加，肿瘤体积减小，表明莪术醇具有体内抑制HCSLCs增殖的能力。HE和TUNEL染色结果显示莪术醇能抑制体内肿瘤增殖，高剂量组TUNEL阳性染色强度（IOD）与对照组差异具有统计学意义（P<0.05）。

3.5 莪术醇抑制HCSLCs的EMT：HepG2-EpCAM细胞分别经30 μM和90 μM莪术醇处理48小时后，WB检测显示莪术醇显著抑制N-钙黏蛋白表达水平，同时增强E-钙黏蛋白表达水平，表明莪术醇可抑制HepG2-EpCAM细胞的EMT过程。

3.6 莪术醇通过抑制Jak2/Stat3通路抑制HCSLCs：经IL-6处理后，HepG2-EpCAM细胞分别暴露于Stat3抑制剂Stattic及30 μM、60 μM和90 μM莪术醇48小时。结果显示莪术醇显著抑制HepG2-EpCAM细胞中Jak2和Stat3蛋白的磷酸化水平，提示莪术醇通过Jak2/Stat3通路抑制HepG2-EpCAM细胞的增殖、迁移和侵袭。

3.7 莪术醇处理的差异表达蛋白磷酸化蛋白质组学特征：对空白对照、30 μM和90 μM莪术醇处理组进行磷酸化蛋白质组学分析，共鉴定到10,282个修饰位点（对应3,425个蛋白），其中9,257个位点（3,184个蛋白）具有定量信息。莪术醇处理后获得889个上调修饰位点和633个上调蛋白，以及248个下调修饰位点和177个下调蛋白。虽然原始数据未检测到特异性磷酸化Jak2或Stat3肽段，但多个上下游效应分子（如MYC、IL6ST、LIFR、EGFR和CXCR4）发生显著变化，与上述Jak2/Stat3磷酸化降低的结果一致。GO富集分析显示差异表达蛋白主要富集于细胞过程、生物调节和代谢过程；亚细胞定位预测显示多数蛋白定位于细胞核（57.36%）、细胞质（16.39%）和质膜（12.29%）；KEGG通路富集分析显示差异表达蛋白主要富集于癌症相关蛋白-多糖信号通路、细胞连接相关信号通路和核糖体相关信号通路。

四、讨论与结论

HCC术后复发和转移率高是肝癌管理中的关键挑战。CSCs通过EMT进入血液的能力是肿瘤发生、进展、复发和转移的主要驱动因素，因此靶向CSCs抑制EMT是有效的癌症治疗策略。中医药在癌症治疗中发挥重要作用，其抗肿瘤策略主要集中于免疫系统调节、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成和直接抑制肿瘤细胞增殖。莪术醇已被报道对HCC等多种恶性肿瘤具有显著抑制作用，但关于莪术醇抗HCSLCs疗效的文献有限。本研究以HCSLCs为模型，结果表明莪术醇有效抑制HepG2-EpCAM细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，提示莪术醇可能通过调控JAK2/STAT3通路（细胞黏附、迁移和侵袭的关键驱动因素）来破坏EMT过程。因此，以莪术醇靶向该通路可能代表抑制HCC转移的新策略。磷酸化蛋白质组学分析为阐明莪术醇作用于HCSLCs的分子机制提供了全面的调控网络图谱。

研究结论：莪术醇通过阻断Jak2/Stat3信号通路抑制EMT，从而抑制肝细胞癌干样细胞的恶性表型。这些发现为莪术醇在靶向肝癌干样细胞的HCC治疗中的潜在应用提供了实验证据。

研究人员同时指出，当前研究主要关注莪术醇处理与Jak2/Stat3通路之间的观察性关联，后续研究将采用敲低和过表达实验及拯救实验来明确验证Jak2/Stat3轴在莪术醇诱导的HCC干细胞抑制中的中介作用。此外，HepG2-EpCAM细胞中的初步结果需要在更多样化的HCC干样模型中得到进一步确认。