《Current Proteomics》：Integrative proteomic and transcriptomic analysis identifies MUC5B as an oncogenic mediator in lung adenocarcinoma: Potential regulation by UCHL1-dependent deubiquitination
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肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的首要原因，每年约夺走180万人的生命。非小细胞肺癌（NSCLC）构成肺癌病例的大多数，并根据小活检和细胞学样本的模式进行分类。在组织学亚型中，肺腺癌（LUAD）是主要形式，约占40%。尽管靶向治疗
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肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的首要原因，每年约夺走180万人的生命。非小细胞肺癌（NSCLC）构成肺癌病例的大多数，并根据小活检和细胞学样本的模式进行分类。在组织学亚型中，肺腺癌（LUAD）是主要形式，约占40%。尽管靶向治疗和免疫治疗取得了进展，但晚期LUAD的五年生存率仍低于20%，这主要源于肿瘤异质性、获得性耐药和远处转移倾向。因此，识别新的分子靶点并阐明其潜在调控机制对于改善临床结局仍至关重要。
细胞外基质（ECM）重塑是肿瘤微环境失调和癌症转移播散的关键病理基础。通过调节细胞黏附、运动和信号转导，ECM重组促进恶性增殖、侵袭性生长和肿瘤细胞远处定植。ECM组分（包括胶原蛋白、黏附分子、基质金属蛋白酶（MMPs）和骨桥蛋白（OPN））的异常表达损害组织结构完整性，促进肿瘤细胞从原发病灶脱离并浸润邻近基质，从而显著促进LUAD及其他恶性肿瘤的侵袭性表型。越来越多的证据表明，黏蛋白家族基因的失调参与肺癌的发生和进展，分泌型黏蛋白在黏液分泌和上皮屏障维持中发挥关键生理作用，并对肿瘤微环境调节产生病理影响。然而，调控LUAD中ECM蛋白稳定性、更新和重塑的精确分子机制，以及特定黏蛋白效应因子及其上游翻译后调控网络的鉴定，仍未得到充分阐明。
蛋白质泛素化和去泛素化是协调蛋白质稳定性、亚细胞定位和功能活性的基本翻译后修饰过程。去泛素化酶（DUBs）通过从底物蛋白上切割泛素链来拮抗蛋白酶体降解，从而维持蛋白质稳态和功能能力。这些酶关键地调控细胞周期进程、凋亡逃逸和癌症干性维持。尽管某些DUBs已被证实在肺癌中异常上调并发挥致癌功能，但其在LUAD中的底物选择性，特别是关于ECM相关蛋白稳定化方面，仍知之甚少。去泛素化是否参与LUAD进展过程中ECM蛋白稳态的调控，以及哪些特定的酶-底物对介导这些过程，是当前理解中的重大空白。
当前肺癌的生物信息学研究主要依赖单独的转录组数据，忽视了蛋白质组水平的表达差异以及转录与翻译输出之间普遍存在的不一致性。因此，仅通过转录组筛选鉴定的靶基因往往临床可转化性有限。此外，大多数现有研究集中于差异基因表达分析，对候选基因的上游修饰机制和通路功能性的实验探究不足。多组学整合协同转录组和蛋白质组分析，为识别具有增强转化潜力的生物学相关靶点提供了稳健的方法学框架。先前肺癌整合研究已记录了mRNA和蛋白质测量之间的显著分歧，强调结合蛋白质组和基因组方法进行严格靶点发现的必要性。然而，专门面向LUAD的大规模转录组和蛋白质组数据集的系统整合，特别是用于识别ECM相关治疗靶点，仍然稀缺。
为解决这些机制空白，本研究采用转录组-蛋白质组整合策略来识别参与LUAD恶性进展的核心基因，随后聚焦于去泛素化介导的ECM相关底物稳定化进行功能和机制验证。本研究预期建立连接LUAD中ECM重塑和蛋白质稳态的先前未表征的翻译后调控轴，并为LUAD分子诊断生物标志物和靶向治疗策略的开发提供新的理论基础。
论文解读
一、研究背景与科学问题
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，每年约导致180万人死亡。非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的大多数，其中肺腺癌（LUAD）是最主要的组织学亚型，约占40%。尽管靶向治疗和免疫治疗不断进步，晚期LUAD患者五年生存率仍低于20%，主要归因于肿瘤异质性、获得性耐药和远处转移倾向。因此，发现新的分子靶点并阐明其调控机制对于改善LUAD临床预后至关重要。
细胞外基质（ECM）重塑是肿瘤微环境失调和转移播散的关键病理基础。ECM组分如胶原蛋白、黏附分子、基质金属蛋白酶（MMPs）和骨桥蛋白（OPN）的异常表达可促进肿瘤细胞侵袭和转移。黏蛋白家族基因的失调已被证实参与肺癌发生发展，但调控ECM蛋白稳定性、更新和重塑的具体分子机制，以及特定黏蛋白效应因子及其上游翻译后调控网络仍不清楚。蛋白质泛素化和去泛素化是调控蛋白质稳定性的基本翻译后修饰过程，去泛素化酶（DUBs）通过切割底物蛋白上的泛素链拮抗蛋白酶体降解。尽管某些DUBs在肺癌中被证实异常上调并发挥致癌功能，但其在LUAD中的底物选择性，尤其是对ECM相关蛋白稳定化的调控，仍缺乏系统研究。
此外，当前肺癌生物信息学研究多依赖单一转录组数据，忽视蛋白质组水平的表达差异以及转录与翻译输出之间的不一致性，导致仅通过转录组筛选的靶基因临床可转化性有限。因此，本研究采用转录组-蛋白质组整合策略，系统识别LUAD恶性进展的核心基因，并聚焦去泛素化介导的ECM相关底物稳定化机制进行功能验证，旨在建立连接ECM重塑与蛋白质稳态的翻译后调控轴，为LUAD分子诊断标志物和靶向治疗策略的开发提供新思路。
二、主要技术方法
研究人员整合了来自GEO数据库的转录组数据集GSE151101（126例患者的237个样本，含113例正常和124例肿瘤样本，Affymetrix Human Gene 1.1 ST Array平台）和来自PCAS数据库的蛋白质组数据集LUAD_Academia_protein（124例正常和124例肿瘤样本，TMT-LC-MS/MS质谱平台），两个数据集来自不同队列，并非同一患者的配对样本。差异表达分析以校正后P<0.05且|log2FC|≥0.263为显著性阈值。随后进行GO和KEGG功能富集分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、九象限图整合分析、维恩交集筛选候选基因，并利用GEPIA和TIMER2.0数据库进行表达验证。体外实验采用siRNA敲低和过表达质粒转染，运用蛋白质印迹（Western blot）、EdU增殖实验、Transwell迁移和侵袭实验、免疫共沉淀（Co-IP）、泛素化实验和放线菌酮（CHX）追踪实验进行功能与机制验证。
三、研究结果
1. 整合转录组和蛋白质组分析鉴定LUAD中一致性失调基因
研究人员对GSE151101转录组数据和LUAD_Academia_protein蛋白质组数据进行差异表达分析，火山图显示大量差异表达基因（DEGs）和差异表达蛋白（DEPs）。热图显示肿瘤与正常样本的清晰聚类模式。九象限图整合分析鉴定出184个在转录水平和蛋白质水平均显著上调的基因，代表LUAD进展的潜在驱动因子。
2. 功能富集分析揭示ECM相关通路激活
GO和KEGG富集分析显示，KEGG通路中"ECM-受体相互作用"通路显著富集。生物学过程（BP）分析中，ECM组织和胶原纤维组织相关条目位列前20。细胞组分（CC）分析显示"细胞外基质""胶原三聚体"和"细胞外区域"显著富集。分子功能（MF）分析鉴定出"细胞外基质结构成分""胶原结合""蛋白质结合"和"整合素结合"等条目。这些结果一致指向LUAD中ECM相关生物学过程的激活。
3. WGCNA鉴定肿瘤相关共表达模块
WGCNA分析选择软阈值β=7（R2=0.863，平均连接度=28.9）构建无符号网络，鉴定出14个共表达模块。模块-性状相关性分析显示turquoise模块与肿瘤状态呈最强正相关（相关系数=0.9，P<0.05），被选为下游靶点鉴定的核心模块。
4. 整合筛选鉴定MUC5B为LUAD核心候选基因
将turquoise模块前600个基因、GeneCards炎症相关前600个基因和九象限图中184个一致性上调基因进行三重维恩交集，鉴定出SOX2和MUC5B两个基因。GEPIA数据库验证显示MUC5B在LUAD肿瘤与正常组织间差异表达最为显著。TIMER2.0泛癌分析显示MUC5B在多种恶性肿瘤中异常表达，在LUAD中表达尤其高。Western blot证实MUC5B蛋白在LUAD细胞系（A549和H1299）中较正常肺上皮细胞16HBE显著上调，而SOX2无显著差异。因此MUC5B被选为主要功能研究对象。
5. MUC5B通过调控ECM相关蛋白表达促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭
在A549和H1299细胞中敲低MUC5B后，EdU实验显示增殖细胞比例显著降低；Transwell迁移实验显示细胞迁移能力明显受抑；Matrigel侵袭实验显示细胞侵袭能力显著下降。Western blot分析显示MUC5B敲低下调了MMP9、COL1A1和OPN的表达。这些结果表明MUC5B通过调控ECM蛋白表达促进LUAD恶性进展。
6. UCHL1与MUC5B相互作用、去泛素化并稳定MUC5B
UbiBrowser数据库预测UCHL1为MUC5B的候选去泛素化酶。Co-IP实验证实A549和H1299细胞中内源性UCHL1与MUC5B蛋白存在物理相互作用。泛素化实验显示敲低UCHL1导致MUC5B泛素化水平显著增加，表明UCHL1可去除MUC5B上的泛素链。CHX追踪实验显示UCHL1沉默加速了MUC5B蛋白降解，表明其蛋白稳定性降低。这些结果支持UCHL1作为MUC5B的去泛素化酶，通过去除泛素修饰维持其蛋白稳定性。
7. MUC5B过表达部分挽救UCHL1沉默的肿瘤抑制效应
Western blot证实si-UCHL1与oe-MUC5B共转染可恢复MUC5B蛋白水平。EdU实验显示MUC5B过表达部分挽救了UCHL1敲低引起的增殖缺陷。Transwell迁移和侵袭实验显示恢复MUC5B表达可减弱UCHL1沉默对细胞迁移和侵袭的抑制作用。Western blot显示MUC5B过表达逆转了UCHL1敲低导致的MMP9、COL1A1和OPN下调。救援实验证实MUC5B作为UCHL1的下游效应因子调控LUAD细胞恶性表型和ECM相关蛋白表达。
四、讨论与结论
讨论部分指出，MUC5B作为分泌型凝胶形成黏蛋白，既往研究对其在肺癌中的表达和预后意义存在不同结论，本研究结果支持MUC5B在LUAD中高表达并促进恶性表型。UCHL1作为去泛素化酶在肺癌进展中发挥致癌作用，本研究首次鉴定MUC5B为UCHL1在LUAD中的新底物，填补了UCHL1-MUC5B去泛素化调控轴在LUAD中的研究空白。研究同时承认了多项局限性，包括缺乏独立临床队列验证、单siRNA序列可能存在的脱靶效应、跨队列整合而非患者水平多组学整合、未能正式证明UCHL1对MUC5B的直接催化去泛素化活性、泛素化实验在天然非变性条件下进行、未确定特异性泛素链连接类型、ECM蛋白表达变化不能直接证明ECM重塑，以及部分救援效应提示UCHL1可能存在MUC5B非依赖性功能。
研究结论：本研究鉴定出UCHL1-MUC5B去泛素化轴作为驱动LUAD进展的先前未报道的调控机制，为靶向治疗开发提供了理论依据，并强调了多组学整合在识别新型癌症治疗靶点方面的巨大潜力。
