TRIM37通过泛素-蛋白酶体途径促进ERα降解并加重ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤

《Current Proteomics》：TRIM37 promotes ERα proteasomal degradation and aggravates ox-LDL-induced endothelial injury in vitro

　　

背景：冠心病（CHD）作为动脉粥样硬化（AS）的并发症，在绝经后女性中发病率较高。该人群中雌激素受体α（ERα，由ESR1编码）表达降低，但其下调的分子机制尚不清楚。目的：探讨三结构域蛋白37（TRIM37）在氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中如何调控ERα，并探究操纵该轴在与富含小细胞外囊泡的制品共培养后是否改变巨噬细胞脂质相关读出指标。方法：以暴露于ox-LDL的HUVECs作为体外模型。采用生物信息学预测、Western blot、GST pull-down、免疫共沉淀（Co-IP）、放线菌酮（CHX）追踪和泛素化实验研究TRIM37-ERα相互作用。通过CCK-8、流式细胞术和管形成实验评估内皮损伤。通过测定活性氧（ROS）、抗氧化酶、内质网应激标志物和炎症因子评估氧化应激、内质网应激和炎症。通过透射电镜、Western blot和纳米颗粒跟踪分析对内皮来源细胞外囊泡进行表征。采用荧光标记和脂质含量检测评估与内皮来源富含细胞外囊泡制品共孵育是否与巨噬细胞脂质相关读出指标变化相关。结果：ox-LDL上调HUVECs中TRIM37表达并下调ERα蛋白水平（P<0.01）。TRIM37通过泛素-蛋白酶体途径与ERα降解相关。敲低TRIM37延长ERα半衰期、降低其泛素化水平并逆转ox-LDL诱导的ERα下调。此外，敲低TRIM37减轻ox-LDL诱导的代谢活性丧失、凋亡增加和管形成能力受损，同时抑制ROS蓄积、恢复抗氧化酶活性并下调内质网应激标志物和炎症因子。所有这些保护效应均与ERα上调相关。HUVEC上清中富集的细胞外囊泡在形态、大小和标志物方面表现出经典特征，并与巨噬细胞呈现明显荧光关联。与TRIM37沉默内皮细胞的富含细胞外囊泡制品共孵育与巨噬细胞甘油三酯（TG）（P<0.001）、总胆固醇（TC）（P<0.01）和类LDL-C胆固醇读出指标降低（P<0.001）以及类HDL-C胆固醇读出指标升高（P<0.001）相关。然而，同时沉默ESR1可逆转这些关联。结论：在ox-LDL刺激的HUVECs中，TRIM37与泛素化依赖性ERα降解相关并加重内皮损伤/炎症。TRIM37沉默细胞的富含细胞外囊泡制品与巨噬细胞脂质读出指标改变相关，但细胞外囊泡的必要性尚未被证实。该候选通路值得在雌激素缺乏和细胞外囊泡清除/抑制模型中进行验证。

研究背景：冠心病（CHD）是全球女性死亡的主要原因之一。女性CHD发病通常较男性延迟约10年，但绝经后女性CHD发病率迅速上升并逐渐接近同龄男性水平，这一模式支持雌激素的关键心血管保护作用。心血管疾病的性别差异与内皮功能障碍密切相关，而内皮功能障碍是绝经后CHD风险升高的关键机制因素。雌激素主要通过与雌激素受体α（ERα，ESR1）和雌激素受体β（ERβ，ESR2）结合发挥生物学效应，其中ERα在内皮细胞中高表达，介导雌激素的抗炎、抗氧化、促血管舒张和抗动脉粥样硬化等保护作用。绝经后女性循环雌激素水平显著下降，导致ERα表达和功能受损，进而引起血管内皮功能障碍并加速动脉粥样硬化（AS）进展。绝经后女性常合并多种妇科疾病（如子宫肌瘤、子宫内膜异位症、卵巢早衰），这些疾病与CHD之间存在显著的临床共病现象，但其分子基础尚不清楚。AS是CHD的核心病理过程，内皮炎症是AS的起始和驱动因素。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是动脉粥样硬化微环境中的关键致病因子，在绝经后女性中常升高，可通过激活内皮细胞、上调黏附分子表达和刺激炎症细胞因子释放触发内皮炎症和氧化应激。蛋白泛素化在心血管疾病研究中日益受到关注。三结构域蛋白37（TRIM37）是一种灵长类特异性E3泛素连接酶，参与蛋白泛素化从而调控底物的稳定性、定位和功能。近期研究提示TRIM37参与内皮损伤：Shi等报道TRIM37通过PPARγ/NF-κB通路加重脑微血管内皮细胞损伤，Wu等证明TRIM37/TRAF2/NF-κB轴参与ox-LDL诱导的HUVEC凋亡和炎症，这些发现确立TRIM37为内皮细胞中的促炎调控因子。然而，TRIM37是否通过泛素化直接调控ERα稳定性并由此影响雌激素相关内皮保护作用仍不清楚。细胞外囊泡通过传递蛋白、脂质和核酸调控细胞间通讯，内皮细胞来源细胞外囊泡是AS病理进展的重要介质，但内皮细胞在动脉粥样硬化条件下是否通过细胞外囊泡依赖途径调控巨噬细胞脂质蓄积和胆固醇稳态仍有待阐明。尽管越来越多证据支持ERα在血管内皮的血管保护功能，但动脉粥样硬化应激下调控ERα蛋白稳定性的翻译后机制仍未完全明确。鉴定触发ERα降解的E3泛素连接酶可能揭示绝经后CHD内皮功能障碍的新驱动因素。既往工作已证明TRIM37参与动脉粥样硬化条件下的血管炎症信号，但TRIM37是否参与雌激素受体依赖的血管保护尚不清楚。阐明TRIM37依赖的ERα周转对于理解ox-LDL刺激损伤状态下血管保护性ERα蛋白为何下降至关重要，并可能有助于解释绝经后女性CHD风险增加的现象。基于上述证据，研究人员建立ox-LDL诱导的HUVEC损伤体外模型以剖析动脉粥样硬化内皮损伤的分子事件，应用生物信息学预测结合体外实验系统确定TRIM37与ERα的相互作用及其通过泛素化的调控机制。本研究旨在阐明TRIM37如何可能通过促进ERα泛素化相关蛋白酶体降解加重内皮损伤和炎症反应，并探究操纵该轴在与富含细胞外囊泡制品共孵育后是否与细胞间通讯改变相关。这些机制观察可能对理解绝经后CHD有意义，并为后续工作探索潜在治疗策略提供体外理论基础，但仍需在雌激素缺乏实验环境中验证。

研究人员开展的研究与结论：研究提示，在ox-LDL诱导的内皮细胞损伤模型中，TRIM37以与ERα泛素化和蛋白酶体降解增加相关的方式加重内皮炎症、氧化应激和内质网应激，且与TRIM37/ERα操纵的内皮细胞来源富含细胞外囊泡制品共孵育与巨噬细胞脂质相关读出指标改变相关；后一发现为相关性结果，未确立细胞外囊泡的必要性。这些发现为理解与绝经后女性CHD风险相关的ox-LDL诱导内皮损伤的分子机制提供了新视角。研究显示ox-LDL刺激上调内皮细胞中TRIM37表达，TRIM37与ERα结合并促进其泛素介导的蛋白酶体降解，从而下调ERα水平。ERα表达受多水平调控，既往研究证明健康绝经后女性ESR1基因远端调控区DNA甲基化降低，提示表观遗传修饰参与低雌激素状态下ERα调控，该研究揭示了ESR1基因的转录调控机制，而本研究从翻译后修饰角度补充了TRIM37介导的泛素-蛋白酶体途径对ERα的翻译后负调控通路，两种机制可能在绝经后不同时间尺度和病理背景下协同作用，共同导致ERα信号受损。ERα（由ESR1编码）的心血管保护作用已被广泛证实，在野生型心肌缺血动物模型中，ERα激活可缩小梗死面积、抑制心肌细胞凋亡、减轻炎症和氧化应激，同时诱导血管舒张和增加新生血管形成，这些发现进一步凸显TRIM37介导的ERα降解在加重血管损伤中的病理意义。TRIM37主要通过介导靶蛋白泛素化和降解参与多种疾病的病理过程。在炎症调控方面，TRIM37被报道通过促进TRAF6的K63连接泛素化负向调控病毒诱导的炎症反应，TRIM37缺失显著减弱骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中病毒促炎细胞因子的产生，强调其在先天免疫信号中的关键作用；近期证据进一步支持TRIM37的促炎调控功能，颗粒物（PM）诱导肺泡上皮细胞中TRIM37自噬降解可保护TRAF6免受蛋白酶体降解，从而激活NF-κB依赖性趋化因子产生和中性粒细胞募集以促进肺转移，这些发现共同表明TRIM37通过泛素化介导的信号网络作为炎症微环境的关键调节因子。同时TRIM37在妇科恶性肿瘤中也发挥关键作用，通过多条信号通路和自噬抑制促进肿瘤进展。鉴于TRIM37既参与心血管病理又参与妇科恶性肿瘤，研究人员推测该E3泛素连接酶可能是连接绝经后女性这些临床共病状况的候选分子节点，但该假设仅源于文献相关性，未获本研究任何实验数据支持，本研究未纳入妇科疾病模型、临床样本或激素谱分析，直接检验此推测性概念需在匹配的心血管与妇科患者队列中研究TRIM37表达和功能并开发合适的双病理动物模型。血管内皮损伤是AS发生的起始事件，ox-LDL诱导的内皮功能障碍、氧化应激、内质网应激和炎症反应是内皮损伤的核心病理特征。本研究中敲低TRIM37减轻ox-LDL触发的HUVEC活力下降、凋亡升高和管形成能力受损，此外敲低TRIM37有效抑制细胞内ROS蓄积、恢复抗氧化酶活性并下调内质网应激标志物和炎症因子表达。值得注意的是，敲低TRIM37的所有这些保护效应均依赖ERα上调。近期研究证实ERα介导的通路可改善去卵巢高脂血症小鼠的绝经后AS，其机制与抑制氧化应激、炎症和凋亡相关。本研究进一步证明TRIM37/ERα轴是ox-LDL诱导内皮损伤的关键调控因子：TRIM37是维持ERα泛素化及后续降解所必需的，从而削弱ERα在内皮细胞环境中的血管保护效应，并可能促成绝经后状态下与CHD风险增加相关的内皮功能障碍。细胞外囊泡作为细胞间通讯的重要介质在AS研究领域受到广泛关注，通过递送多种生物活性物质，细胞外囊泡通过调控炎症、脂质代谢和血管内皮功能介导AS发生、进展和消退的多阶段调控过程。本研究提供初步证据表明，内皮细胞中TRIM37-ERα轴的操纵与富含细胞外囊泡制品共孵育后巨噬细胞脂质相关读出指标改变相关。不同干预处理的内皮细胞来源小细胞外囊泡符合小细胞外囊泡的经典特征并与巨噬细胞呈现明显荧光关联。具体而言，与TRIM37敲低内皮细胞的富含细胞外囊泡制品共孵育与巨噬细胞TG、TC和类LDL-C胆固醇读出指标降低以及类HDL-C胆固醇读出指标升高相关，相反同时沉默ESR1可逆转这些关联。关于巨噬细胞内胆固醇池改变的来源，需澄清M0巨噬细胞维持于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，提供外源性脂蛋白作为细胞胆固醇经清道夫受体摄取和内吞的底物。内皮来源富含细胞外囊泡制品可能通过传递生物活性货物（如调控蛋白、miRNA）影响胆固醇流入、流出或酯化途径从而影响巨噬细胞胆固醇稳态，而非直接递送大量LDL颗粒。因此观察到的类LDL-C和类HDL-C胆固醇亚组分变化反映与内皮来源细胞外囊泡共培养后巨噬细胞胆固醇处理能力和细胞内再分布的改变，而非外源性ox-LDL直接负载于巨噬细胞。这一发现作为体外观察具有重要病理生理意义。越来越多证据表明ox-LDL激活的巨噬细胞释放的细胞外囊泡能够通过骨形态发生蛋白7/视神经萎缩蛋白1通路促进AS病理进展并调控脂质代谢；此外有报道炎症内皮细胞外囊泡作为功能性介质可通过丝裂原活化蛋白激酶/核因子κB信号通路调控巨噬细胞功能并促进巨噬细胞活化。本研究的潜在新颖性在于将供体内皮细胞中运行的TRIM37-ERα泛素化轴与富含细胞外囊泡制品共孵育后巨噬细胞脂质相关读出指标改变相联系。确切货物仍有待确定，在将因果作用归于细胞外囊泡前需进行细胞外囊泡必要性对照。这为后续工作探索内皮功能障碍与动脉粥样硬化进展之间的分子桥梁提供了重要方向。

讨论部分与结论：本研究存在若干重要局限性。第一，内皮细胞实验使用HUVECs，即新生静脉来源内皮细胞系，而非人冠状动脉内皮细胞，静脉内皮细胞获得的结果可能无法完全再现与CHD发病相关的冠状动脉内皮细胞的生物学行为；观察到的巨噬细胞脂质相关改变的细胞外囊泡依赖性未获正式确立，未进行功能缺失对照，如细胞外囊泡清除的条件培养基、囊泡破坏处理、供体内皮细胞囊泡释放抑制或蛋白酶、RNase或去污剂进行货物类别消化，因此不能排除可溶性蛋白、脂蛋白或共分离污染物的贡献。第二，本体外研究未建立绝经特异性实验激素微环境，因此结论不能直接外推至绝经后病理生理；具体而言未采用雌激素清除培养基、雌二醇补充、ESR1药理激动剂或拮抗剂以及绝经前或绝经后供体原代内皮细胞。第三，所有机制观察均来自体外细胞培养系统，无体内动物模型数据或人类临床样本，仅使用HUVECs和THP-1来源巨噬细胞两种细胞类型，HUVECs为脐静脉内皮细胞，可能无法完全再现冠状动脉内皮细胞或绝经后血管微环境，未来研究应在原代人冠状动脉内皮细胞、雌激素缺乏动物模型和临床样本中验证这些发现。第四，介导巨噬细胞脂质相关改变的内皮分泌细胞外囊泡内特定货物分子仍未鉴定。第五，泡沫细胞形成由细胞内脂质生化测定间接推断，未通过油红O或BODIPY染色直接进行泡沫细胞形成的形态学评估。第六，细胞外囊泡纯化流程缺乏MISEV2023指南推荐的若干严格对照，可能增加非囊泡成分污染风险；DIO标记摄取实验缺乏必要阴性对照，包括经完整标记流程处理的染料-only对照、z轴正交共聚焦成像、内体膜共定位分析和细胞外荧光淬灭实验，无法明确区分真正的细胞内囊泡内化与表面相关染料伪影。第七，本研究统计效能有限，所有功能实验包括流式细胞术凋亡和ROS荧光定量均采用n=3生物学重复，虽在体外机制研究中常见，但n=3不足以可靠检测小到中等效应，尤其对于凋亡和ROS等高变异读出指标，观察到的效应量可能被夸大或不精确，这些分析应视为探索性，未来研究应采用先验效能计算和更大样本量，理想情况下高变异终点n≥5。第八，虽使用两条独立靶向TRIM37的shRNA序列以降低脱靶风险，但未完成抗shRNA的拯救实验，RNA干扰的潜在脱靶效应不能完全排除。最后，鉴于TRIM37是一种具有许多潜在下游底物的多功能E3泛素连接酶，治疗性抑制TRIM37的长期安全性、脱靶效应和内皮选择性仍未知，因此任何转化治疗意义必须谨慎解读。虽进行了细胞活力剂量-反应和时间进程实验以支持选择100 μg/mL ox-LDL处理24 h，但未在所有浓度和时间点系统评估TRIM37和ERα蛋白水平等分子读出指标；此外虽采用变性免疫沉淀和MG132预处理检测ERα泛素化，但未确定泛素链连接类型（K48与K63）和特定ERα受体赖氨酸残基，需用纯化E1、E2、TRIM37、ERα和泛素进行无细胞泛素化重构以及催化失活TRIM37突变体才能证明直接酶催化，因此TRIM37目前应被视为ERα泛素化的候选调控因子而非正式确立的ERα E3连接酶。总之，本研究证明E3连接酶TRIM37与ox-LDL处理内皮细胞中ERα泛素化相关蛋白酶体降解增强相关，从而削弱雌激素介导的血管保护作用；此外，内皮细胞中TRIM37/ERα轴的操纵与富含细胞外囊泡制品共孵育后巨噬细胞脂质相关读出指标改变相关，但细胞外囊泡必要性未确立，该观察应视为假设生成性。该发现揭示了ox-LDL诱导内皮损伤下调控ERα蛋白稳定性的新翻译后调控机制。虽然TRIM37可能是未来研究的候选分子，但其治疗或预防绝经后女性CHD的转化价值仍未证实，必须在原代人类细胞、临床样本和动物模型中检验。天然化合物和药理干预在临床前模型中已显示对心肺损伤的保护作用，但类似策略能否特异性靶向内皮细胞中的TRIM37-ERα轴仍有待确定。本工作仅为探索妇科共病与CHD之间分子联系的进一步研究奠定体外理论基础。