整合转录组学、WGCNA与机器学习识别弥漫性大B细胞淋巴瘤肿瘤进展关键生物标志物VCAM1

《Current Proteomics》：Integrated transcriptomics, WGCNA and machine learning identify key biomarkers associated with tumor progression in diffuse large B-cell lymphoma

　　

摘要 背景 弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是一种高度异质性和侵袭性的恶性肿瘤，但其关键生物标志物及潜在分子机制仍不明确。 方法 研究人员采用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）鉴定疾病相关模块。基于GSE56315数据集筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），并通过取DEGs、WGCNA模块基因与GeneCards数据库中DLBCL相关靶点的交集获得候选基因。应用LASSO回归与随机森林算法鉴定关键基因。利用CIBERSORT评估免疫细胞浸润。通过公共数据库及蛋白质印迹法验证关键基因表达。采用EdU、管形成及流式细胞术检测细胞增殖、血管生成、细胞周期分布及凋亡。利用异种移植小鼠模型评估体内肿瘤生长。 结果 WGCNA鉴定出青绿色模块和蓝色模块（分别包含1689个基因，相关系数r = ?0.99，P = 6e?83；r = ?0.99，P = 4e?75）与DLBCL显著相关。3202个DEGs、模块基因及872个GeneCards靶点取交集后获得50个候选基因。LASSO回归保留17个基因，而随机森林鉴定出一个排名最高的基因。两种机器学习结果的交集确定血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1）为唯一共享的关键基因。VCAM1在DLBCL中上调。敲低VCAM1可抑制DLBCL细胞的增殖与血管生成，诱导G0/G1期细胞周期阻滞并促进凋亡，伴随Bcl-2表达下降、Bax表达升高以及p-p65和p-IκBα水平降低。体内实验进一步证实，沉默VCAM1可抑制裸鼠肿瘤生长。 结论 VCAM1可能参与DLBCL进展，值得作为候选生物标志物和潜在治疗靶点进行进一步评估。

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一、研究背景与目的

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常见的亚型，约占确诊病例的30%至40%。尽管含利妥昔单抗的免疫化疗方案显著改善了患者预后，但仍有约30%至40%的患者出现复发或难治性疾病。DLBCL具有显著的生物学异质性，在肿瘤行为、组织病理特征、临床表现和治疗反应方面表现出巨大差异，最终导致不同的临床结局。因此，阐明驱动DLBCL的精确分子机制，寻找稳健且具有临床相关性的生物标志物以改善风险分层并探索潜在治疗靶点，已成为亟待解决的科学问题。

传统的差异表达分析虽能识别肿瘤与正常组织间的表达变化基因，但难以揭示基因间的协同调控关系。为此，研究人员引入了系统生物学方法，旨在更准确地识别核心功能基因。本研究采用了一种整合转录组学分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、机器学习及免疫浸润分析的多维生物信息学策略，并结合体外实验与体内研究，全面表征DLBCL中潜在关键分子的表达模式、功能角色及分子基础，为该疾病的诊断和治疗提供新的机制理解和候选靶点。

二、主要研究方法

研究人员从NCBI GEO数据库获取GSE56315数据集（包含55例DLBCL样本和33例健康对照样本）。主要关键技术方法包括：1）使用R语言WGCNA包构建基因共表达网络，通过软阈值分析选择β=20以满足无尺度拓扑标准，经动态树切割和模块合并后鉴定与DLBCL表型显著相关的模块；2）利用limma包进行差异表达分析（|log2倍变化| > 2，校正后P值 < 0.01），并从GeneCards数据库检索DLBCL相关靶点（相关性评分 > 50）；3）采用LASSO回归（五折交叉验证，基于lambda.min准则）和随机森林算法（基于变量重要性评分）从候选基因中筛选关键基因；4）使用CIBERSORT算法评估22种免疫细胞类型的相对比例，并进行Spearman相关性分析；5）通过体外实验（EdU增殖实验、管形成实验、流式细胞术检测细胞周期和凋亡、蛋白质印迹法）和体内异种移植小鼠模型验证关键基因的功能。

三、研究结果

WGCNA鉴定与DLBCL相关的基因模块

对GSE56315数据集中88个样本的6000个高变异基因构建WGCNA，经动态树切割和模块合并后得到五个共表达模块。模块-性状相关性分析显示，青绿色模块（相关系数 = ?0.99，P = 6e?83）和蓝色模块（相关系数 = ?0.99，P = 4e?75）与DLBCL状态呈最显著负相关。根据|模块隶属度（module membership，MM）| > 0.3和|基因显著性（gene significance，GS）| > 0.9的标准，从这两个模块中共保留1689个枢纽基因用于后续分析。

DLBCL中差异表达基因的鉴定及候选基因筛选

差异表达分析共鉴定出3202个DEGs。同时从GeneCards数据库检索到872个DLBCL相关基因。将3202个DEGs、1689个WGCNA模块基因和872个GeneCards预测靶点取交集，获得50个候选枢纽基因，并利用STRING数据库构建了这些基因的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。

通过机器学习鉴定关键基因

LASSO回归基于最优λ值（lambda.min）从50个候选基因中筛选出17个特征基因。随机森林算法根据变量重要性评分保留了一个排名最高的基因。两者取交集后，唯一共享的关键基因为血管细胞黏附分子1（VCAM1）。ROC曲线分析显示，LASSO和随机森林模型在五折交叉验证、独立测试集和留一法交叉验证中的AUC均为1.000，准确率、敏感性和特异性也均为1.000，表明模型在当前数据集中具有良好的判别性能。

VCAM1与DLBCL免疫细胞浸润的相关性

CIBERSORT分析显示，与健康对照组相比，DLBCL组中初始B细胞、活化树突状细胞、活化肥大细胞、单核细胞和静息NK细胞的比例显著降低，而M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、静息肥大细胞、活化NK细胞、静息CD4记忆T细胞、CD8 T细胞、滤泡辅助T细胞和γδT细胞的比例显著升高。相关性分析表明，VCAM1表达与CD8 T细胞、活化CD4记忆T细胞、活化NK细胞和M0巨噬细胞的浸润水平呈正相关，而与初始B细胞、静息NK细胞、活化树突状细胞和活化肥大细胞呈负相关。

VCAM1在DLBCL中表达上调

GSE56315数据集和TCGA数据的GEPIA数据库分析均证实VCAM1在DLBCL组织中表达显著高于健康对照。与人B淋巴细胞GM12878细胞相比，DLBCL细胞系U2932和TMD8中VCAM1蛋白水平升高。转染shVCAM1后，VCAM1蛋白表达显著降低，确认了敲低效率。

敲低VCAM1抑制DLBCL细胞的增殖和血管生成

EdU实验表明，VCAM1敲低抑制了U2932和TMD8细胞的增殖。管形成实验显示，VCAM1敲低后分支点数量显著减少，表明VCAM1可能促进DLBCL细胞的促血管生成能力。使用第二条独立的shRNA（shVCAM1#2）以及过表达VCAM1的实验进一步验证了VCAM1在DLBCL细胞中的促肿瘤作用。

VCAM1敲低诱导DLBCL细胞周期阻滞并促进凋亡

流式细胞术分析显示，VCAM1敲低增加了U2932和TMD8细胞在G0/G1期的比例，同时减少了S期细胞群，表明发生G0/G1期细胞周期阻滞。凋亡实验显示，VCAM1沉默提高了DLBCL细胞的凋亡率。蛋白质印迹法证实，VCAM1敲低上调了促凋亡蛋白Bax的表达，下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

激活NF-κB信号通路可部分逆转VCAM1敲低在DLBCL细胞中的作用

为探讨NF-κB信号通路是否参与VCAM1的生物学效应，研究人员使用NF-κB通路激活剂PMA进行了拯救实验。PMA处理部分逆转了VCAM1敲低对细胞增殖和管形成的抑制作用，缓解了G0/G1期阻滞并减少了凋亡。蛋白质印迹法显示，VCAM1敲低降低了p-p65和p-IκBα的水平，而PMA处理恢复了其表达水平，表明VCAM1的作用可能与NF-κB信号通路有关。

VCAM1敲低在体内抑制肿瘤生长

在异种移植小鼠模型中，与shControl组相比，shVCAM1组的肿瘤生长显著受抑，表现为终点肿瘤体积和重量减小。免疫组织化学染色显示，shVCAM1组Ki67阳性细胞比例显著降低，VCAM1蛋白表达减少，表明VCAM1沉默在体内抑制了肿瘤生长和增殖。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究存在若干局限性。首先，生物信息学发现和机器学习模型评估主要基于GSE56315数据集，缺乏完全独立的外部临床队列验证，因此观察到的诊断性能可能偏乐观，VCAM1的普适性和临床相关性尚不确定。其次，体外实验仅使用了ABC亚型的U2932和TMD8细胞，VCAM1的功能及其与NF-κB信号的关系可能更适用于ABC-DLBCL，不能直接推广至所有DLBCL亚型。第三，VCAM1调控NF-κB信号的上游机制尚不清楚，是否涉及VLA-4依赖性信号、可溶性VCAM1或自分泌/旁分泌调节等仍需进一步研究。第四，未确定DLBCL组织中VCAM1的具体细胞来源，未来需结合空间或共定位分析加以阐明。

研究结论：本研究整合了转录组学分析、WGCNA、差异表达筛选和机器学习方法，结合免疫浸润分析，鉴定出VCAM1是与DLBCL相关的候选生物标志物。功能实验表明，沉默VCAM1可抑制细胞增殖和血管生成，触发细胞周期阻滞和凋亡，并在体内减少肿瘤生长。VCAM1对DLBCL进展的影响可能涉及NF-κB信号通路。这些数据为DLBCL的分子机制提供了新见解，并强调了VCAM1作为诊断和治疗靶点的潜在临床价值。