《Biomarker Insights》：Integrated Bulk and Single-Cell Transcriptomic Analyses Nominate IER3 as a Glycolysis-Associated Candidate Marker in Diabetic Foot Ulcers
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摘要专业翻译
背景：糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers, DFUs）以慢性炎症、再上皮化受损和代谢紊乱为特征。然而，DFUs中糖酵解相关转录改变的景观仍未完全阐明。
目的：优先筛选DFUs中糖酵解相关候选基因，并探究IER3的细胞分布及推断
摘要专业翻译
背景：糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers, DFUs）以慢性炎症、再上皮化受损和代谢紊乱为特征。然而，DFUs中糖酵解相关转录改变的景观仍未完全阐明。
目的：优先筛选DFUs中糖酵解相关候选基因，并探究IER3的细胞分布及推断的拟时序表达模式。
设计：对公共批量及单细胞转录组数据进行的探索性回顾性分析。
方法：使用GSE134431（13例DFU及8例糖尿病足皮肤样本）进行共表达及差异表达分析。无符号网络采用幂指数14。名义差异表达筛选辅以Benjamini-Hochberg敏感性分析。LASSO、随机森林（random forest, RF）及线性支持向量机（support vector machine, SVM）分析使用更新后的候选基因池。条件性能通过100次重复五折交叉验证评估。固定四基因模型采用Firth逻辑回归重新拟合。GSE80178用于次要候选评估，而非独立验证。单细胞转录组分析使用来自GSE165816的14个样本。
结果：两个显著模块包含5,486个基因。与5,721个差异表达基因及89个糖酵解相关基因重叠产生14个候选基因；FDR敏感性分析保留11个，其中包括IER3。六基因全数据共识包含IER3，但其三方法重采样共识频率为39.0%。平均条件折外LASSO AUC为0.888。IER3在GSE134431中的表观AUC为0.933，在GSE80178中为1.000。四基因模型的留一法AUC为0.933。单细胞质量控制保留44,887个细胞；IER3表达在不同细胞群体及推断的基底角质细胞拟时序中均有变化。
结论：IER3代表DFUs中一个探索性的糖酵解相关候选基因，而非已确立的生物标志物。这些发现为未来使用更大队列及实验方法进一步阐明IER3在DFU生物学中的作用奠定了基础。
论文解读文章
一、研究背景与问题
糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers, DFUs）是糖尿病严重的并发症之一，以慢性难愈性创面、反复感染、活动能力受损及下肢截肢风险增加为特征，给临床和医疗系统带来沉重负担。创面修复是一个高耗能过程，需要角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞及免疫细胞等多种细胞类型间的协调代谢适应。在慢性糖尿病创面中，持续高血糖、炎症和组织缺氧可破坏代谢稳态，损害角质细胞迁移、血管生成、细胞外基质重塑及免疫调节等关键过程。越来越多的证据表明，糖酵解重编程在调节创面微环境中发挥重要作用。例如，巨噬细胞HIF-1α介导的糖酵解信号有助于组织修复表型，而角质细胞、巨噬细胞与愈合相关成纤维细胞间的相互作用影响创面愈合进程。此外，单细胞转录组研究已揭示与DFU再上皮化缺陷相关的角质细胞状态改变及炎症细胞间通讯网络紊乱。然而，DFU中糖酵解相关转录变化的贡献及细胞背景仍未得到充分表征。
既往DFU生物信息学研究主要聚焦于免疫调节和炎症反应，识别了如GSTM5等潜在候选基因，但许多研究依赖于有限的数据集或单一计算方法。整合多种分析策略并结合单细胞分辨率，可能为候选基因优先排序及其在糖尿病创面微环境中的细胞分布提供更多见解。因此，研究人员开展本研究，旨在结合批量转录组分析、共表达网络分析、糖酵解相关基因注释、多算法特征优先排序及单细胞转录组分析，以识别DFU相关的糖酵解候选基因并表征其在创面相关细胞群体中的表达模式。
二、主要技术方法
研究人员使用了多项关键生物信息学技术方法。数据来源于基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）：GSE134431（13例DFU和8例糖尿病足皮肤样本）作为发现数据集，GSE80178（6例DFU和3例糖尿病足皮肤样本）用于次要候选评估，单细胞分析使用GSE165816的14个DFU足部皮肤样本。主要方法包括：加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）以识别DFU相关共表达模块；limma差异表达分析筛选差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）；与分子特征数据库（Molecular Signatures Database）中GOBP_GLYCOLYTIC_PROCESS基因集（含89个独特基因）进行三重重叠；LASSO、随机森林（random forest, RF）和线性支持向量机（support vector machine, SVM）三种机器学习算法进行特征排序；Firth惩罚逻辑回归构建固定四基因模型；单细胞RNA测序数据分析（Seurat聚类、UMAP/t-SNE可视化）进行细胞类型注释；Monocle2拟时序分析推断基底角质细胞轨迹；CellChat推断细胞间配体-受体通讯。
三、研究结果
3.1 DFU相关共表达模块：在幂指数14的网络中，包含23,537个基因，产生20个非灰色模块。两个模块满足修正后的FDR < 0.05选择标准：darkolivegreen模块含1,280个基因（r = 0.651，FDR = 0.0187），包含IER3；darkmagenta模块含4,206个基因（r = -0.638，FDR = 0.0187）。两模块并集含5,486个基因。在幂指数16下，无模块达到该FDR阈值，表明模块选择对该参数敏感。
3.2 差异表达及重叠糖酵解相关基因：差异表达分析鉴定出764个上调和4,957个下调基因，共5,721个DEGs。三重重叠（模块基因、DEGs、糖酵解基因）产生14个候选基因：ACTN3、BPGM、HIF1A、HK2、IER3、KAT2B、LDHA、MLXIPL、P2RX7、PFKFB1、PFKFB2、PGAM1、PGAM4和TIGAR。Benjamini-Hochberg敏感性分析保留11个候选基因，包括IER3。
3.3 机器学习特征排序：全数据LASSO在lambda.1se下保留BPGM、IER3、KAT2B、MLXIPL、P2RX7和PFKFB2六个基因，且均出现在RF和SVM的前10特征中。在100次重复交叉验证中，平均条件折外LASSO AUC为0.888。IER3在52.2%的外层训练分割中被LASSO选择，其RF和SVM前10频率分别为98.6%和51.6%，三方法共识频率为39.0%，低于P2RX7的94.0%。
3.4 候选基因的探索性评估与优先排序：固定四基因（GPD1、BPGM、KAT2B、IER3）Firth模型表观AUC为0.990，留一法AUC为0.933。经1,000次bootstrap重采样，乐观校正后AUC为0.968。IER3在两个数据集中DFU组表达均高于糖尿病足皮肤组。IER3在GSE134431中的表观AUC为0.933（95% bootstrap CI，0.798-1.000），在GSE80178中为1.000（基于9个样本，不构成独立外部验证）。
3.5 预测的IER3-转录因子网络：网络包含15个预测转录因子：TP53、TFAP2A、SP1、RELA、NFKB1、FOXA1、E2F1、CTCF、ATF7、ATF6、ATF5、ATF4、ATF3、ATF2和ATF1。富集注释包括线粒体自噬、TNF、MAPK、细胞衰老和凋亡通路。
3.6 IER3的单细胞定位：质量控制保留44,887个细胞，聚类为11种广泛细胞类型。IER3在多种细胞类型中表达，在基底角质细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、分化角质细胞和髓系细胞中表达显著。
3.7 基底角质细胞拟时序：基底角质细胞被细分为十个转录亚群，沿Monocle2轨迹排序，包含五个状态、两个分支点。IER3沿轨迹表达变化显著（P = 1.472 × 10-44，q = 3.423 × 10-43）。
3.8 基底角质细胞参与的预测通讯：CellChat汇总了119个独特配体-受体相互作用、723个显著阳性细胞对连接和31条信号通路。基底角质细胞作为发送者的突出预测输出涉及髓系细胞和MIF相关信号，作为接收者的突出预测输入涉及成纤维细胞和MDK相关信号。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究通过糖酵解相关基因筛选，整合批量与单细胞转录组分析将IER3识别为DFU相关候选基因。然而，研究强调“糖酵解相关”仅描述IER3进入分析的途径，数据未测量葡萄糖摄取、乳酸产生或糖酵解通量，不能证明IER3调控DFU中的糖酵解。IER3是即刻早期应激反应基因，在炎症和凋亡中具有背景依赖性作用，其表达升高可能反映细胞应激而非DFU特异性机制。研究局限性包括：批量队列规模小且临床异质性大、GSE80178参与了候选优先排序而非独立验证、幂指数14的尺度自由拓扑拟合R2 = 0.696低于0.80、单细胞流程未记录Harmony执行、双联体去除及环境RNA校正、线粒体阈值40%较为宽松且未进行阈值敏感性分析。
研究结论为：整合转录组分析将IER3识别为DFU中一个探索性的糖酵解相关候选基因，并揭示其在基底角质细胞及其他创面相关细胞群体中的表达。观察到的诊断性能、拟时序相关表达模式及推断的细胞相互作用为IER3在糖尿病创面愈合中的生物学背景提供了潜在见解。未来需纳入更大临床队列和实验验证的研究，以进一步阐明IER3在DFU中的生物学作用及转化意义。
