荆防合剂通过调控与肠-皮肤轴相关的AMPK/p38 MAPK/PI3K-Akt通路缓解OVA/Al(OH)3诱导的荨麻疹样大鼠炎症的多组学研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Multi-omics analysis revealed that Jingfang Mixture alleviates inflammation in an OVA/Al(OH)3-induced urticaria-like rat model by regulating the AMPK/p38 MAPK/PI3K-Akt pathway associated with the gut-skin axis

　　

摘要 背景：荨麻疹的全身性与复发性特征无法仅用皮肤肥大细胞活化来完全解释。肠道是否参与其中，以及荆防合剂（JF）这类多组分复方是否通过肠-皮肤途径发挥作用，尚未在微生物群、代谢物和皮肤信号传导的水平上被一并检验。方法：采用卵清蛋白（OVA）/Al(OH)₃诱导的荨麻疹样过敏性炎症大鼠模型，整合16S rRNA基因测序、粪便非靶向代谢组学和基于DIA（数据非依赖型采集）的皮肤定量蛋白质组学，以探究JF的治疗机制。结果：JF同时抑制Th2型（IgE（免疫球蛋白E）、IL-4（白细胞介素-4））和Th17/促炎型（IL-6（白细胞介素-6）、TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、IL-17（白细胞介素-17））应答，改善肠屏障相关异常，并通过恢复产短链脂肪酸（SCFA）菌（Bacteroidia、Clostridia、Lachnospirales、Oscillospirales）同时减少Proteobacteria和Enterobacterales，部分逆转肠道菌群失调。JF使粪便代谢组正常化，升高包括丁酸、吲哚、吲哚-3-乙酸、二十二碳六烯酸（DHA）在内的抗炎代谢物，并降低花生四烯酸、白三烯B4、次级胆汁酸等促炎介质。在皮肤层面，JF激活AMPK（AMP活化蛋白激酶）信号并抑制异常的p38 MAPK（p38丝裂原活化蛋白激酶）和PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）-Akt（蛋白激酶B）活化。Spearman相关分析进一步揭示，SCFA（短链脂肪酸）和吲哚衍生物与AMPK通路相关蛋白丰度呈正相关，与p38 MAPK和PI3K-Akt蛋白呈负相关，而促炎代谢物则呈现相反的关联模式。结论：总体而言，研究人员的发现表明JF减轻荨麻疹样炎症，可能通过肠道菌群及调节SCFA、胆汁酸、色氨酸和脂质代谢实现。这一多组学证据提示JF可能通过肠道菌群-代谢物-皮肤信号轴发挥抗荨麻疹获益。尽管如此，仍需进一步的因果验证实验和临床研究。

荨麻疹是以一过性风团、剧烈瘙痒或血管性水肿为临床特征的免疫炎症性皮肤病，其发病涉及肥大细胞异常活化、Th1/Th2免疫失衡、IgE驱动的超敏反应及多种促炎介质释放。越来越多的证据提示荨麻疹并非单纯的局部皮肤过敏性疾病，而是以广泛免疫失调和慢性低度炎症为特征的全身性疾病。全球疾病负担研究2021报告显示，过去三十年间荨麻疹的全球疾病负担持续增加并预计将继续上升。目前第二代H1抗组胺药是一线临床治疗，但相当一部分患者存在疗效不足、复发率高、剂量依赖性耐受问题及嗜睡等不良反应，因此亟需探索安全性好、疗效确切且具多靶点调控优势的替代或辅助治疗策略。

从中医角度看，荨麻疹主要归因于风寒湿邪侵袭肌表，导致营卫不和。荆防合剂（JF）源自明代医籍《摄生众妙方》所载经典方"荆防败毒散"，具有疏风散寒除湿的传统功效，临床应用历史逾400年。中医关于外感风寒湿邪扰乱内在生理稳态的概念，与现代肠-皮肤轴假说存在概念上的重叠，后者认为肠道微环境紊乱可通过全身免疫和代谢信号驱动远端器官的炎症反应。既往药理学研究已记录JF在荨麻疹相关模型以及自身免疫性肝炎等其他免疫相关疾病中的抗炎和免疫调节作用。中医理论与当代系统生物学见解的概念趋同为研究人员提出"JF通过肠-皮肤轴改善荨麻疹"的假设提供了启发。

在将中药复方转化为现代药理学证据时，合适的疾病模型对于界定机制发现的可解释与可转化范围不可或缺。本研究采用OVA/Al(OH)₃诱导的荨麻疹样大鼠模型，该模型可重现急性IgE介导皮肤炎症的核心特征，但不能重现临床慢性自发性荨麻疹（CSU）的慢性、复发性和自身免疫性病程，因此结果应解释为急性荨麻疹样炎症的临床前证据，而非直接外推至CSU。迄今JF抗荨麻疹作用的分子机制仍未完全阐明。近年来肠-皮肤轴理论强调肠道菌群及其代谢物可通过调节肠屏障完整性和宿主免疫应答重塑皮肤免疫微环境。大量证据表明肠道微生物代谢物是连接共生菌群与宿主免疫调节的关键功能信使，广泛参与免疫相关疾病（包括炎症性肠病、类风湿关节炎和荨麻疹）的发病。荨麻疹患者常存在肠道菌群失调和代谢紊乱，例如SCFA丰度降低和胆汁酸代谢异常，可能加重皮肤表现。综上，研究人员假设JF通过肠道菌群-代谢物-皮肤信号轴缓解荨麻疹样炎症，且该作用可能与皮肤中AMPK激活及p38 MAPK/PI3K-Akt抑制相关。

综上，研究人员假设JF的治疗获益与重塑肠道微生物组成、改变关键微生物代谢物生成以及抑制局部皮肤炎症相关，但连接JF触发的肠道菌群、代谢物和皮肤免疫应答改变的直接实验证据仍然缺乏。尽管OVA/Al(OH)₃诱导模型不能完全重现人类CSU的异质性免疫特征和慢性复发病程，但其提供了可重复的IgE相关过敏性炎症实验系统，部分反映荨麻疹的关键免疫学特征，因此采用该模型评估JF干预后的全身免疫、代谢和皮肤反应。为填补上述知识空白，研究人员采用OVA/Al(OH)₃诱导的荨麻疹样过敏性炎症大鼠模型，整合16S rRNA基因测序、粪便非靶向代谢组学和基于DIA的皮肤定量蛋白质组学等多组学方法，系统刻画JF驱动的肠道微生物组成、粪便代谢特征和皮肤蛋白表达模式变化，并采用Spearman相关分析探讨肠道菌群、代谢物与皮肤蛋白之间的潜在关联。本研究旨在描绘与JF治疗相关的多组学改变，并在该临床前模型中揭示可能的肠道菌群-代谢物-皮肤串扰，为后续机制研究奠定基础。

研究人员用到的主要关键技术方法包括：JF的UPLC-MS化学指纹图谱表征；OVA/Al(OH)₃诱导的荨麻疹样大鼠模型（SD大鼠，辽宁长盛生物技术有限公司，许可证号SCXK（辽）2020-0001，共192只雄性，设正常对照、模型、西替利嗪阳性对照及五个剂量JF组）；皮肤与结肠H&E染色及病理评分、甲苯胺蓝染色评估肥大细胞脱颗粒；ELISA检测血清HIS、IL-4、IL-6、IL-17、IgE、TNF-α、DAO、D-LAC；基于DIA的皮肤定量蛋白质组学（Q Exactive HFX，Proteascape分析，UniProt Rattus norvegicus数据库）；16S rRNA V3-V4区测序（Illumina NovaSeq 6000，QIIME2/DADA2，Silva 138数据库）；粪便非靶向代谢组学（UPLC-Synapt G2-Si，Compound Discoverer处理）；免疫组化与Western blot检测AMPK/p38 MAPK/PI3K-Akt磷酸化水平；Spearman相关分析。

结果部分：

3.1 JF的化学表征：UPLC-MS指纹图谱共初步注释152种主要化学成分，包括Prim-O-glucosylcimifugin、5-O-methylvisammioside、Saikosaponin A、Saikosaponin D、glycyrrhizic acid、liquiritin和ferulic acid；萜类和黄酮类曾被报道可调控AMPK信号级联并抑制炎症反应；3批次主要特征成分RSD低于5%，批间一致性良好。

3.2 JF减轻荨麻疹大鼠模型的皮肤炎症和瘙痒：模型组大鼠出现频繁搔抓和便溏，提示造模成功；JF以剂量和时间依赖方式改善这些病理表现。H&E染色显示模型组皮肤病变明显，包括表皮增生、真皮水肿和大量炎性细胞浸润，各JF组呈不同程度组织学改善，JF2、JF4、JF6保护效力更优。治疗第14天，这三个JF组疗效优于阳性对照（CH）组；至第21天，所有JF干预组均优于CH组，提示明显的时间累积药效。搔抓行为实验证实JF显著降低搔抓频率并改善OVA/Al(OH)₃所致皮肤损伤。JF2组在第21天疗效最显著：与Con组相比，模型组出现明显红斑、风团样病变及皮肤增厚（P<0.01），JF2显著逆转上述皮肤表现（P<0.01）。甲苯胺蓝染色显示模型组肥大细胞脱颗粒率较Con组显著升高（P<0.001），JF2显著降低脱颗粒（P<0.01）。效应量分析显示JF2在红斑面积、肥大细胞计数和组织学评分方面优于JF6，在肥大细胞丰度方面优于JF4，故选择JF2组（1.2 g/kg/day，约为临床等效大鼠剂量的2倍）进行后续机制研究。

3.3 JF抑制全身过敏性炎症反应并改善肠屏障标志物：与Con组相比，模型组血清IgE、IL-4（P<0.01）和组胺（P<0.001）显著升高，提示Th2偏倚免疫激活和肥大细胞脱颗粒；血清IL-6、TNF-α、IL-17也明显升高（P<0.01），表明全身炎症激活强烈；JF降低上述所有指标（P<0.01），其中IL-6和TNF-α的降低伴随皮肤炎性细胞浸润减轻。紧密连接（TJs）蛋白复合物对维持肠道生理稳态不可或缺，血清DAO和D-LAC是反映肠屏障结构完整性和通透性改变的可靠循环标志物；模型组DAO和D-LAC浓度大幅升高，JF给药有效逆转这一异常升高（P<0.05）。结肠H&E染色显示模型组上皮改变和炎性细胞浸润，JF处理组结肠黏膜结构恢复，其中JF2改善最为明显。需注意本研究未直接检测紧密连接蛋白、未进行在体肠道通透性实验及循环内毒素/LPS定量。

3.4 JF通过减少Proteobacteria和恢复产SCFA菌逆转荨麻疹模型大鼠肠道菌群失调：16S rRNA测序显示，与Con组相比模型组α多样性（Chao1和Observed species指数）显著降低（P<0.05），JF干预后部分恢复；β多样性分析显示Con、模型和JF组肠道微生物群落组成明显分离。门水平上模型组Proteobacteria相对丰度升高、Bacteroidetes降低；目水平上Lachnospirales和Oscillospirales降低，JF逆转这些组成扰动。LEfSe分析在多个分类水平识别出判别性菌群：目水平Enterobacterales在模型组富集，科水平Enterococcaceae在模型组富集，属水平Bacteroides和Lachnospira在JF组富集。差异菌群热图与上述结果一致：模型组门水平Proteobacteria升高，目水平Enterobacterales升高，科水平Enterococcaceae升高；同时多个有益菌群耗竭，包括纲水平Bacteroidia和Clostridia，目水平Bifidobacteriales、Erysipelotrichales、Oscillospirales和Lachnospirales，科水平Barnesiellaceae和Coprostanoligenes group，属水平Lachnospira、Odoribacter、Butyricimonas和Anaerostipes，种水平Lactobacillus intestinalis和Parabacteroides distasonis；这些菌群多参与SCFA产生、屏障维持和免疫调节。JF治疗在很大程度上逆转了这些菌群组成紊乱。

3.5 JF使粪便代谢组正常化，升高SCFA和色氨酸代谢物并降低促炎胆汁酸和LTB₄：肠道菌群大多通过生物活性微生物代谢物发挥功能，因此采用非靶向LC-MS/MS代谢组学刻画粪便代谢物。PCA可将Con、模型和JF组分离，提示荨麻疹样炎症重塑了粪便代谢组，而JF治疗使代谢谱向Con组正常状态回移。OPLS-DA结合VIP筛选鉴定出24种差异代谢物。与Con组相比，模型组粪便丁酸、吲哚、吲哚-3-乙酸和DHA水平显著降低（P<0.05），这些代谢物具有明确的抗炎和免疫调节活性；同时促炎介质包括脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、花生四烯酸（AA）和白三烯B₄（LTB₄）在模型组显著蓄积（P<0.05）。代谢通路富集分析表明这些差异代谢物主要参与SCFA代谢、胆汁酸代谢、色氨酸代谢和脂质代谢，JF干预显著恢复上述所有代谢异常。丁酸和吲哚衍生物是肠道菌群来源的具有强效抗炎和免疫调节能力的生物活性分子，而脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、花生四烯酸及其下游代谢物LTB₄是经典促炎介质；这些代谢变化与JF触发的肠道菌群重塑密切相关。综上，JF通过恢复SCFA、色氨酸和脂质代谢有效逆转荨麻疹相关粪便代谢紊乱，升高抗炎代谢物（丁酸、吲哚衍生物、DHA）同时降低促炎胆汁酸和LTB₄，从而再平衡肠道代谢微环境。

3.6 JF可能与恢复皮肤AMPK信号并抑制荨麻疹模型大鼠异常p38 MAPK和PI3K/Akt信号通路激活相关：采用DIA定量蛋白质组学分析皮肤组织蛋白表达谱，在P<0.05和|log2FC|≥1阈值下，模型与对照组间鉴定出107个差异表达蛋白（53个上调、54个下调），JF与模型组间鉴定出243个差异表达蛋白（128个上调、115个下调），JF处理后差异蛋白数量明显扩大，提示JF触发皮肤蛋白调控网络的广谱重塑。GO功能富集分析显示，模型与对照组差异蛋白主要富集于免疫相关功能（免疫球蛋白复合物、适应性免疫应答、抗原结合、T细胞受体结合、CD8⁺ T细胞活化）及脂质代谢过程（脂肪酸延伸、类固醇生物合成、胆固醇代谢）；而JF与模型组差异蛋白显著富集于线粒体呼吸链复合物I、复合物I组装和线粒体电子传递，这一发现关键——复合物I是氧化磷酸化的限速组分，直接决定ATP产生和细胞内NAD⁺/NADH比值，是AMPK活性的关键上游调节因子。KEGG通路富集分析进一步显示模型组差异蛋白富集于脂质代谢通路（类固醇生物合成、脂肪酸延伸、不饱和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢）及多条免疫相关信号级联；JF干预组差异蛋白显著富集于脂质代谢（不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸延伸、鞘脂代谢、醚脂代谢）以及AMPK和PI3K-Akt信号通路。基因集富集分析（GSEA）独立验证JF组AMPK信号通路显著富集，而模型组p38 MAPK通路富集。AMPK是整合细胞能量代谢与炎症调节的枢纽，其激活可抑制促炎应答并调节脂质代谢；模型组p38 MAPK通路富集提示其参与荨麻疹相关炎症。综上，多组学数据表明模型组AMPK信号受抑而p38 MAPK级联病理性过度激活，JF治疗逆转这一病理信号状态；核心信号分子蛋白丰度热图进一步展示JF驱动的改变。

3.7 Spearman相关分析提示肠道菌群、代谢物与皮肤蛋白之间的潜在关联：研究人员对差异菌群、差异粪便代谢物和蛋白质组学鉴定的皮肤AMPK/p38 MAPK/PI3K-Akt信号轴关键蛋白进行Spearman相关分析。菌群-代谢物相关方面，属水平上Lachnospira、Butyricimonas、Odoribacter和Anaerostipes与抗炎代谢物（花生四烯酸、3-oxohexadecanoic acid、5-oxooctadecanoic acid、脱氧胆酸等）显著相关（P<0.05），而Desulfovibrio属与这些代谢物负相关；Anaerostipes和Lachnospiraceae-UCG-006与吲哚及吲哚-3-乙酸负相关，与丁酸和丙酸等SCFA正相关。代谢物-皮肤蛋白相关方面，丁酸与AMPK通路蛋白（Ulk1、Pfkfb4、Scd3）正相关，与p38 MAPK蛋白（Map3k6、Map3k7）和PI3K-Akt蛋白（Efna1、Zfp36）负相关；吲哚和吲哚-3-乙酸与AMPK蛋白（Ulk1、Pfkfb4）正相关，与p38 MAPK蛋白（Kcnj8、Map3k6、Map3k5、Mapk14）和PI3K-Akt蛋白（Efna1、Col6a1、Col6a2、Col6a3）负相关；相反，花生四烯酸、白三烯B₄、3-oxohexadecanoic acid、5-oxooctadecanoic acid和脱氧胆酸与p38 MAPK和PI3K-Akt蛋白正相关，与AMPK蛋白负相关（P<0.05）。总体而言，这些相关性提示JF治疗后肠道菌群、代谢物与皮肤蛋白之间可能存在关联，但属探索性和假设生成性分析，并非因果推断。

3.8 JF上调荨麻疹模型大鼠皮肤p-AMPK并下调p-p38 MAPK、p-PI3K和p-Akt：为对上述蛋白质组学发现进行生化验证，采用IHC和WB定量大鼠皮肤样本中AMPK、p38 MAPK、PI3K和Akt的磷酸化及总蛋白水平。IHC显示Con组p-AMPK呈中等阳性染色，而p-p38 MAPK、p-PI3K和p-Akt仅见微弱免疫反应；模型组p-AMPK染色面积和信号强度显著降低（P<0.05），而p-p38 MAPK、p-PI3K和p-Akt免疫反应性大幅增强（P<0.05），主要定位于表皮角质形成细胞胞质和真皮炎性细胞浸润区；JF干预逆转这些改变，p-AMPK升高（P<0.01），p-p38 MAPK、p-PI3K和p-Akt降低（P<0.05）。Western blot定量与IHC观察一致：与Con组相比模型组p-AMPK/AMPK比值显著降低（P<0.01），JF治疗使其恢复（P<0.05）；相反模型组p-p38/p38、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值大幅升高（P<0.01），JF给药后显著降低（分别为P<0.01、P<0.05和P<0.05）。综上，IHC和WB结果证实JF在荨麻疹样模型大鼠皮肤中上调p-AMPK并下调p-p38 MAPK、p-PI3K和p-Akt，这种靶向AMPK/p38 MAPK/PI3K-Akt信号轴的相互调节模式可能促成JF对该大鼠模型荨麻疹样过敏性炎症的保护作用。

讨论部分：第二代H1抗组胺药不能使所有荨麻疹患者获得充分症状缓解，凸显了剖析皮肤肥大细胞活化之外全身病理机制的必要性。累积证据支持肠-皮肤串扰是荨麻疹发病的重要促成因素，但JF驱动的肠道微生物组成和粪便代谢谱改变是否与皮肤炎症及免疫代谢信号存在功能联系仍未完全阐明。本研究在OVA/Al(OH)₃诱导的荨麻疹样过敏性炎症大鼠模型中整合肠道微生物组、粪便代谢组和皮肤蛋白质组数据集，以检验这一潜在跨腔室关系。在病理学上，荨麻疹以肥大细胞活化和2型免疫应答为特征，促进组胺释放及下游炎症级联；此外越来越多证据提示Th17相关炎症参与慢性荨麻疹，与本动物模型中观察到的IL-17升高一致。JF的治疗活性体现在三个相互关联的生物学层面：第一，JF降低IgE及多种炎症细胞因子（包括IL-4、IL-6、TNF-α和IL-17），提示对过敏反应和炎症反应均有作用；第二，完整的肠屏障功能对维持宿主免疫稳态不可或缺，肠屏障完整性受损后内毒素和微生物产物可易位入循环并进一步放大炎症反应，JF改善肠屏障相关病理异常并纠正肠道菌群失调，血清DAO和D-LAC降低及结肠组织病理改善提示肠屏障功能障碍减轻，与既往关于肠高通透性与荨麻疹疾病严重度相关的报道一致；第三，JF恢复粪便代谢组，升高SCFA和吲哚代谢物同时减少促炎脂质介质和胆汁酸种类。机制上，丁酸通过G蛋白偶联受体或抑制组蛋白去乙酰化酶调节T细胞分化并抑制IL-4和IL-17产生；吲哚衍生物代谢物强化肠屏障并促进宿主免疫耐受；花生四烯酸是包括LTB₄在内的炎症脂质介质前体，后者可通过白三烯受体信号促进炎症。JF化学表征鉴定出萜类、黄酮类和生物碱等多种主要生物活性成分，既往药理学研究证实这些化合物具有抗炎和免疫调节活性，其中若干可调控AMPK信号，支持JF对肠-皮肤轴的多靶点作用至少部分归因于这些生物活性成分的假设。此外，JF处理后差异蛋白中富集线粒体呼吸链复合物I相关蛋白，提示线粒体能量代谢相关过程改变，但线粒体改变是否直接促成AMPK磷酸化增强尚待阐明，这提示JF可能在线粒体能量代谢层面作用于AMPK激活上游。作为协调细胞能量代谢和炎症控制的中心枢纽，活化AMPK可抑制PI3K-Akt级联、减少促炎细胞因子分泌并促进脂肪酸氧化。本研究中JF治疗增加AMPK磷酸化同时降低p38 MAPK、PI3K和Akt磷酸化水平，这些发现得到蛋白质组学、GSEA富集和免疫组化结果的一致支持。多组学相关分析揭示肠道菌群-代谢物-皮肤信号关联的协调变化，但因果关系尚待建立；未来机制研究可采用类似多糖研究的实验框架，整合个体肠道微生物组成、代谢组谱和宿主遗传背景构建个性化计算肠道生态系统模型，以验证"微生物-代谢物-宿主"因果调控链，此类验证实验因时间和研究资源限制未在当前工作中实施。除单个分子靶点外，这些发现强化了荨麻疹与全身肠-皮肤器官间通讯相关的认识，并揭示SCFA生物利用度与皮肤AMPK活性之间的潜在功能联系，为这一既往概念性描述的肠-皮肤轴现象提供可量化实验证据。对中医研究而言，本研究为理解经典疏风类方剂同时作用于肠道和皮肤腔室的多靶点治疗机制提供了生物学解释框架；所采用连接16S rRNA数据、代谢组谱和蛋白质组变化的多组学方法，使研究人员能够识别肠道生态改变、代谢输出和皮肤信号事件之间的协调关联，该整合策略尤其适合研究肠-皮肤轴这类复杂系统，单层分析无法捕捉跨腔室串扰。需注意蛋白质组学和Spearman相关分析每组仅n=3个生物学重复，样本量较小削弱统计效能并可能产生不稳定相关估计，因此组学衍生和通路水平发现应视为探索性和假设生成性，需扩大样本量的后续研究独立验证。研究结论翻译：这项临床前研究提供证据表明，JF通过减轻皮肤病变和全身炎症反应并改善肠屏障相关异常，缓解OVA/Al(OH)₃诱导的大鼠荨麻疹样过敏性炎症。JF治疗伴随肠道微生物组成、粪便代谢和皮肤AMPK/p38 MAPK/PI3K-Akt信号的协调变化。整合的多组学数据支持一个可能与JF抗炎作用相关的潜在肠道菌群-代谢物-皮肤信号网络，并为进一步机制和转化研究提供基础。研究人员同时指出若干局限：该动物模型重现荨麻疹样急性过敏性炎症但无法反映人类CSU的慢性复发病程；仅纳入雄性大鼠限制结论外推；16S rRNA测序反映相对丰度且未设阴性对照、未行qPCR绝对定量；相关性分析仅支持关联而非因果，亟需粪菌移植和介导SCFA触发皮肤AMPK激活的细胞表面受体鉴定等因果验证实验；肠屏障完整性通过循环DAO/D-LAC标志物和结肠组织学评估，未直接检测紧密连接蛋白丰度及功能性通透性实验；JF为复方制剂，其体内保护作用的具体活性化合物尚未明确；ELISA试剂盒虽经厂家验证但缺乏详细交叉反应数据且未独立验证。总体而言，JF作为荨麻疹多靶点治疗候选物值得进一步临床前和转化评估，但仍需严格临床验证，未来可检验SCFA补充、AMPK激活和微生物导向辅助干预的治疗潜力。