SLC14A1 c.230G>A变异导致Kidd抗原表达缺失及其功能验证

《Frontiers in Immunology》：A SLC14A1 c.230G>A variant causes loss of Kidd antigen expression

　　

背景：Kidd（Jk）血型系统（Kidd blood group system）由SLC14A1基因编码的Jk^a、Jk^b和Jk3抗原定义。Jk(a-b-)表型（Jk(a-b-) phenotype）以这些抗原缺失为特征，是一种人群频率低的罕见血型表型，其分子基础主要与SLC14A1基因变异相关。在此，研究人员鉴定出一名携带变异的Jk(a-b-)表型个体，并评估该变异是否影响Jk抗原表达。方法：通过常规血清学分型鉴定Jk(a-b-)表型。采用聚合酶链反应序列分型（polymerase chain reaction sequence-based typing，PCR-SBT）分析SLC14A1基因编码序列，并使用单分子测序（single-molecule sequencing）进行单倍型分析。通过体外转染和表达试验评估变异的功能影响，并使用流式细胞术（flow cytometry）检测转染细胞上的Jk^b抗原表达。还使用计算机模拟预测工具（in silico prediction tools）评估变异的潜在功能影响。结果：先证者缺乏Jk^a、Jk^b和Jk3抗原。PCR-SBT在SLC14A1基因四个外显子中鉴定出三个杂合单核苷酸变异（single-nucleotide variants，SNVs）和两个纯合SNVs。单分子测序显示两个单倍型：一个包含c.342-1G>A、c.588A>G和c.838G>A，另一个包含c.230G>A、c.499A>G、c.588A>G和c.838G>A。计算机模拟分析预测c.230G>A为有害变异，并提示其改变与邻近原子的相互作用。功能试验显示，转染JK(c.230G>A+c.499A>G+c.588A>G+c.838G>A)的细胞不表达Jk^b抗原，而转染JK*02等位基因或JK(c.499A>G+c.588A>G+c.838G>A)的细胞表现出高水平Jk^b抗原表达。结论：鉴定出一个JK null等位基因（JK null allele）及其关键SNV，并通过转染和表达研究证实该变异的功能效应。

研究背景与问题：Kidd（Jk）血型系统包含Jk^a、Jk^b和高频抗原Jk3，由SLC14A1（solute carrier family 14 member 1，溶质载体家族14成员1）基因编码。Jk(a-b-)表型为红细胞缺乏Jk^a、Jk^b和Jk3，呈罕见分布；既往报告频率在日本为0.002%（14/638,460），中国为0.008%（16/201,194），波利尼西亚为0.27%（47/17,300）。Kidd糖蛋白为尿素转运体，Jk(a-b-)红细胞在2 mol/L尿素中至少30分钟才溶血，而其他表型1分钟内溶血，因此尿素溶血试验可用于筛查。Jk(a-b-)个体可经输血或妊娠产生抗Jk3，导致严重急性和迟发性溶血性输血反应，故需筛选相应供者。其分子基础与SLC14A1变异相关，国际输血协会血型数据库（International Society of Blood Transfusion Blood Group Database，ISBT Blood Group Database）已登记61个JK null等位基因；多数为JK*01或JK*02背景上的单核苷酸变异，部分含两个或以上变异。问题在于Jk(a-b-)罕见，且杂合非功能等位基因可能不被尿素试验识别；此外c.230G>A曾在中国山东Jk(a-b-)个体中发现，推断单倍型与本研究相同，但未进行功能分析。因此研究人员对一名浙江省血液中心自愿献血者中的Jk(a-b-)个体携带的c.230G>A进行分子表征和功能验证。

研究内容与意义：研究人员通过尿素溶血试验筛查献血者，对先证者及其父母进行血清学分析，采用PCR-SBT和单分子测序确定SLC14A1变异及单倍型，并用计算机模拟、结构建模和体外转染表达试验评价c.230G>A的功能影响。研究结论为：先证者为Jk(a-b-)表型，携带分别位于不同单倍型的c.342-1G>A和c.230G>A；c.230G>A所在单倍型被ISBT命名为JK*02N.35，功能试验提示该变异导致Jk^b抗原表达缺失。该研究为JK null等位基因谱补充了数据，并为c.230G>A作为关键SNV导致Jk抗原表达缺失提供了功能证据。

关键技术方法：样本来源为浙江省血液中心参加自愿献血的献血者，共筛查20,000份，并另采集先证者父母标本，均获知情同意。方法包括：用2 mol/L尿素溶血试验筛查Jk(a-b-)表型；对阳性者以血清学方法（试管法、吸收放散试验、微柱凝胶抗人球蛋白法）检测Jk^a、Jk^b和Jk3抗原；用PCR-SBT分析SLC14A1外显子3至10及侧翼序列；用纳米孔单分子测序进行单倍型分析；用计算机模拟预测工具和基于PDB 6QD5的结构建模评价变异；构建野生型和变异表达质粒转染CHO（Chinese hamster ovary，中国仓鼠卵巢）细胞，以流式细胞术检测Jk^b抗原平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）。

研究结果：3.1 Jk(a-b-) phenotype was identified by the serology method。通过20,000份献血者尿素溶血筛查仅1例抵抗溶血；试管法和吸收放散试验显示先证者红细胞与抗Jk^a、抗Jk^b无凝集，微柱凝胶抗人球蛋白法显示与抗Jk3无凝集，对照Jk(a+b-)、Jk(a+b+)、Jk(a-b+)有2+或1+凝集；先证者血浆未检出意外抗体；父母血清学分别呈Jk(a-b+)和Jk(a+b-)。结论为先证者属Jk(a-b-)表型。3.2 The sequence of the SLC14A1 using Sanger sequencing。PCR-SBT在四个外显子检出三个杂合SNVs和两个纯合SNVs：c.230G>A（rs2511219464，p.Ser77Asn）在外显子4，c.342-1G>A在剪接位点，c.499A>G（rs2298719，p.Met167Val）和c.588A>G（rs2298718，p.Pro196Pro）在外显子6，c.838G>A（rs1058396，p.Asp280Asn）在外显子8；父母分别检出3个和4个SNVs。3.3 Identification the haplotype using the single-molecule sequencing method。单分子测序两个扩增子分别获53,368和71,683 reads，平均覆盖345和506；鉴定单倍型c.342-1G>A+c.588A>G+c.838G>A为JK*02N.29，另一单倍型c.230G>A+c.499A>G+c.588A>G+c.838G>A为JK*02等位基因（c.230G>A变异等位基因），已被ISBT正式命名为JK*02N.35；父亲携带JK*02N.29和JK*02（with c.588G），母亲携带JK*01和c.230G>A变异等位基因；c.230G>A变异等位基因序列提交GenBank（PX780294），该变异在SNP数据库rs2511219464中，等位基因频率未报道。3.4 In silico prediction for missense variants。多个工具预测三个错义变异影响SLC14A1功能但结果因算法而异；c.230G>A被PROVEAN、SIFT、MutPred2和PhD-SNP分类为有害或疾病相关，被FATHMM和MutationTaster判为耐受；c.499A>G和c.838G>A被所有工具预测为耐受或良性。3.5 Structural modeling。基于SLC14A1 X射线晶体结构（PDB：6QD5）建模：野生型Ser77与Asn74、Ile81和Ala248形成极性相互作用（与Asn74两个氢键3.2 ?和3.0 ?，与Ile81一个2.9 ?氢键，与Ala248一个3.1 ?氢键）；p.Ser77Asn变异中Asn77与Asn74和Ala248相互作用（与Asn74两个氢键3.2 ?和3.0 ?，与Ala248一个2.8 ?氢键），但与Ile81的氢键丢失。结论为变异改变空间结构中的氢键相互作用。3.6 Analysis of Jkb antigen expression on the transfected cells。转染JK*02（Jk^b）和JKV2的细胞高表达Jk^b抗原；转染JKV1的细胞无可检测Jk^b表达，MFI与空载体对照相当；统计显示JKb组和JKV2组MFI显著高于空载体（p<0.05），JKV1与空载体无差异（p>0.05），JKV1与JKb、JKV1与JKV2差异有统计学意义（p<0.01），JKV2与JKb差异有统计学意义（p<0.05）。结论为c.230G>A变异提示可能使Jk^b抗原表达缺失。

讨论部分总结：Jk(a-b-)在一般人群中罕见，中国人群中频率很低；尿素试验可能漏检SLC14A1杂合非功能等位基因。c.838G>A决定Jk^a/Jk^b多态性；c.499A>G和c.588A>G亦为多态位点，c.588A>G不关联Jk^a或Jk^b抗原表达，而c.499A>G单独或与c.838G>A联合是否影响抗原表达尚未见报道，但据ISBT血型数据库不导致Jk(a-b-)表型。先证者5个核苷酸变化中，c.499A/G、c.588G/G、c.838A/A既往报告不关联Jk(a-b-)表型，故进一步分析c.230G/A和c.342-1G/A。三代长读长测序（third-generation long-read sequencing，TGS）已用于Kidd系统基因型-表型差异及SLC14A1 null和弱表达等位基因的单倍型判定；本研究中单分子测序显示c.230G>A和c.342-1G>A位于不同单倍型。c.342-1G>A是JK*02N.29的特征性改变，可导致转录时外显子5跳跃，既往与Jk(a-b-)相关。c.230G>A既往在山东Jk(a-b-)个体中发现，推断单倍型为c.230G>A+c.499A>G+c.588A>G+c.838G>A，与本研究相同，但既往未分析其功能。因此研究人员进一步研究c.230G>A：计算机模拟预测其为有害，结构分析提示其改变与邻近残基的氢键相互作用，转染c.230G>A重组构建体的细胞未检测到Jk抗原表达，提示c.230G>A可能废除抗原表达。据ISBT数据库，外显子4的c.202C>T、c.220A>G、c.222C>A、c.299C>T与Jk(a-b-)相关，c.226G>A、c.277G>A与弱Jk抗原表达相关；进一步用蛋白空间结构分析这些变异有助于理解外显子4变异导致抗原缺失或弱表达的机制。局限性包括：未进行总蛋白表达减少、折叠受损、浆膜转运受损或抗原表位改变等实验，流式细胞术虽显示转染细胞Jk^b抗原丢失，但不能完全确立机制；CHO细胞可能受内源性SLC14A1表达影响；结构分析中丢失一个预测氢键的功能未进一步实验验证，故结构分析不能作为机制证据；先证者c.342-1G>A和c.230G>A位于不同单倍型，c.342-1G>A已是确立的null等位基因，但本研究未通过实验证据确立其效应。

研究结论部分翻译：总之，通过血清学分析鉴定出一名Jk(a-b-)表型个体，长读长测序显示c.230G>A和c.342-1G>A位于不同单倍型。功能试验中，c.230G>A变异可使相应抗体检测的转染CHO细胞MFI值显著降低。此外，基于PDB结构6QD5的结构分析显示Ser77/Asn77周围的氢键相互作用发生改变，计算机模拟工具提示c.230G>A可能为有害或疾病相关。然而，这些数据未通过独立的功能实验确认。