意大利中部猪屠宰场废水样本中的病毒病原体：一项为期一年的分子监测

《Frontiers in Microbiology》：Viral pathogens in effluent samples collected from a swine slaughterhouse in Central Italy: a 1-year molecular surveillance

　　

摘要 引言： 对食品工业环境样品中人兽共患和物种特异性病毒病原体进行分子筛查，对于获取流行病学数据以支持基于风险的评估至关重要，尤其是在屠宰场等场所。 方法： 本研究筛选了2025年1月至12月期间从意大利中部一个家猪屠宰场内两个地点（存栏区V1和污水处理厂V2）采集的72份废水样本。调查的病毒包括星状病毒（astrovirus）、甲型肝炎病毒（hepatitis A virus, HAV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）、诺如病毒（norovirus, NoV）和轮状病毒（rotavirus, RV）。采用实时逆转录定量聚合酶链式反应（real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）和巢式逆转录聚合酶链式反应（nested reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）进行病毒检测，随后进行系统发育分析。 结果： 结果显示，37.50%的样本中至少检测到一种目标病毒的核糖核酸（ribonucleic acid, RNA），其中HEV3-c检出率为26.39%，NoV-GII.3为12.50%，NoV-GI.4为9.72%。在阳性废水样本中，62.96%采集自V1，37.04%采集自V2。来自V1的样本表现出更高的病毒载量，HEV RNA水平达到105基因组当量/毫升（genome equivalents per milliliter, GE/mL），NoV-GI和NoV-GII RNA水平达到103 GE/mL；而来自V2的样本中，HEV RNA水平为103 GE/mL，NoV-GI和NoV-GII RNA水平为101 GE/mL。 讨论： 在污水处理厂处理前后均检测到病毒RNA序列，这凸显了关于人兽共患和物种特异性病毒可能向环境扩散的科学与监管担忧。对这些环境基质管理和监测方面的监管空白，强调了采用多学科方法解决这一“全健康”（One Health）问题的重要性。

论文解读：意大利中部猪屠宰场废水中病毒病原体的分子监测研究

一、研究背景与目的

食品安全和肉类消费需求的持续增长推动了畜牧业和屠宰加工行业的发展。屠宰场作为动物、人类和环境交汇的关键节点，是监测包括人兽共患和物种特异性病原体在内的微生物制剂的重要场所。戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）和诺如病毒（norovirus, NoV）等病毒性人兽共患病原体可在环境中持续存在，其传播风险不容忽视。此前的研究多聚焦于直接从屠宰线上采集的动物组织、血清和粪便样本，而对屠宰场废水作为病毒潜在传播途径和环境指示物的作用认识不足。特别是在意大利，尚缺乏针对屠宰场废水中病毒病原体的系统性分子监测研究。此外，现行的欧洲废水管理法规（欧盟指令第271/1991号）主要关注细菌等微生物指标，并未涵盖病毒参数，存在明显的监管空白。因此，本研究旨在通过对意大利中部一家家猪屠宰场两个关键点位——存栏区（V₁）和污水处理厂（wastewater treatment plant, WWTP）（V₂）的废水样本进行为期一年的分子监测，提供关于HEV、NoV等人兽共患病毒RNA在环境中循环的流行病学数据，评估废水处理工艺的效果，并探讨其对公共健康和“全健康”（One Health）理念的意义。

二、关键技术方法

研究人员于2025年1月至12月，以每10天一次的频率，从意大利马尔凯大区一家家猪屠宰场的存栏区（V₁）和污水处理厂处理后出水口（V₂）各采集1升废水样本，共计72份。所有样本首先进行病毒浓缩，然后提取核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）。主要采用实时逆转录定量聚合酶链式反应（real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）对星状病毒（astrovirus, AstV）、甲型肝炎病毒（hepatitis A virus, HAV）、HEV、NoV（GI和GII基因群）和轮状病毒（rotavirus, RV）的RNA进行初步筛查和定量。所有RT-qPCR阳性结果均通过巢式逆转录聚合酶链式反应（nested reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）进行确认，并对扩增产物进行Sanger测序和系统发育分析，以确定病毒的基因型和亚型。同时，还对样本进行了总细菌数（total bacterial count, TBC）、总大肠菌群数（total coliform count, TCC）和大肠埃希氏菌数（Escherichia coli count, ECC）等细菌学指标的测定。

三、研究结果

3.1 病毒总体检出情况

在72份废水样本中，37.50%（27/72）至少检测到一种目标病毒RNA。若将单一检出和共同检出的样本都计算在内，阳性样本的总比例为48.61%（35/72）。

3.2 各病毒检出率

在所有样本中，HEV RNA的检出率最高，为26.39%（19/72），占所有阳性检出谱的54.28%。NoV RNA的总检出率为22.22%（16/72），占阳性检出谱的45.71%。其中，NoV-GII的检出率为12.50%（9/72），NoV-GI为9.72%（7/72）。AstV、HAV和RV在所有样本中均未检出。

3.3 不同采样点病毒分布

V₁（存栏区）样本的阳性率（23.61%，17/72）高于V₂（污水处理厂后）样本（13.89%，10/72）。HEV RNA在V₁和V₂的检出率分别为27.78%（10/36）和25.00%（9/36）。NoV-GII在V₁的检出率（22.22%，8/36）显著高于V₂（2.78%，1/36）。NoV-GI在V₁和V₂的检出率分别为11.11%（4/36）和8.33%（3/36）。值得注意的是，所有V₂阳性的样本，其对应的同日V₁样本也均为阳性。另有25.00%（9/36）的V₁样本为阳性而其对应V₂样本为阴性，其中77.78%（7/9）为NoV-GII阳性。

3.4 病毒载量与统计分析

V₁样本的病毒载量普遍高于V₂样本。HEV RNA在V₁的最高载量可达10⁵ GE/mL，而在V₂则为10³ GE/mL。配对t检验显示，V₁和V₂之间的病毒载量存在统计学显著差异（p = 0.041），其中HEV RNA的差异尤为显著（p = 0.040）。双因素方差分析（two-way analysis of variance, ANOVA）结果表明，季节性和每日屠宰量对病毒载量有显著影响（p = 0.043）。在冬季（寒冷月份），屠宰量高峰（最高达483头/天）伴随着更高的病毒RNA载量（HEV达10⁵ GE/mL，NoV达10³ GE/mL），而春夏季则较低（HEV为10³ GE/mL，NoV为10¹ GE/mL）。

3.5 病毒基因分型与系统发育分析

所有HEV阳性样本经测序鉴定均为HEV基因3型亚型3c（HEV3-c）。获得的代表序列（GenBank登录号：PX925942等）与来自欧洲人类血液/血清、意大利猪粪便及巴基斯坦污水中的HEV序列显示出100%的核苷酸同源性。NoV-GI阳性样本被鉴定为NoV-GI.4，其序列（GenBank登录号：PX910003等）与意大利阿布鲁佐地区未经巴氏消毒的山羊奶中发现的NoV-GI.4序列高度同源。NoV-GII阳性样本被鉴定为NoV-GII.3，其序列（GenBank登录号：PX924506等）与意大利伦巴第地区和韩国污水处理厂废水及人类粪便中的NoV-GII.3序列最为相似。

3.6 细菌学指标

V₁样本中的细菌载量极高（平均TBC为1.59×10⁹ CFU/mL）。经过污水处理厂处理后，V₂样本的细菌载量大幅降低（平均TBC为2.10×10³ CFU/mL），且ECC低于检出限，符合意大利法律（第152/2006号）规定的排放标准。

四、讨论与结论

本研究的讨论部分强调，这是意大利首次对猪屠宰场废水进行多种病毒病原体的分子监测。研究结果证实，屠宰场废水是人兽共患病毒（HEV、NoV）进入环境的潜在载体。与以往主要关注城市污水的监测相比，本研究发现HEV的检出率（26.39%）相对较高，而NoV的检出率（22.22%）与部分意大利城市污水研究结果相当。系统发育分析揭示了这些病毒序列与人类临床样本、其他动物（猪、山羊）及环境样本（污水）中的病毒序列存在高度的遗传相似性，暗示了病毒在不同宿主和环境间的潜在传播网络。

研究还发现，虽然污水处理厂的生物处理工艺（活性污泥法加氯消毒）能有效降低细菌负荷，使其达标排放，但并不能完全清除病毒RNA。V₂样本中仍可检测到HEV和NoV RNA，尽管载量有所下降。这表明现有的以细菌指标为核心的废水处理标准和监管框架不足以应对病毒污染的风险。病毒的结构稳定性使其能在不利环境条件下（如低温、低pH值、氯化处理）持续存在。

研究结论翻译： 本研究是意大利首个聚焦于猪屠宰场废水中病毒病原体分子筛查的调查。它通过考察两个关键采样点——存栏区（V₁）和污水处理厂（V₂），旨在提供沿废水流动路径的病毒RNA循环的流行病学概览。从监管角度看，屠宰场废水管理属于欧盟指令91/271/EEC下的工业废水管理范畴。在当前监管框架所涉及的参数中，微生物指标主要关注细菌。此外，将于2027年8月起取代现行指令的修订版欧盟监管框架（指令(EU) 2024/3019）引入了重要的挑战和优先事项，包括抗菌素耐药性、微塑料和促进循环经济。然而，病毒病原体并未在该监管框架中被明确提及，这突显了废水病毒污染管理与监测方面持续存在的差距。因此，鉴于病毒制剂在环境中的广泛传播及其与“全健康”的相关性，有必要在废水监测中加入病毒特异性参数。病毒在不利环境和理化条件下潜在的持久性进一步强化了这一关切，这可能反映了病毒衣壳在废水基质中的结构稳定性。在此背景下，分子监测是表征病毒RNA循环和生成特定环境病毒学及流行病学数据的有价值方法。此类监测有助于识别潜在的环境传播途径，并为制定更全面的监测策略提供支持。