耐受性树突状细胞经黏膜免疫—肠道菌群—丁酸盐轴减轻胶原诱导性关节炎

《Frontiers in Immunology》：Tolerogenic dendritic cells attenuate collagen-induced arthritis through a mucosal immunity–gut microbiota–butyrate axis

　　

摘要 背景： 耐受性树突状细胞（TolDCs）正被开发用于恢复自身免疫性疾病中的抗原特异性免疫耐受。然而，其在自身免疫性关节炎中的治疗效果是否涉及肠道—关节轴的调节仍不清楚。 方法： 使用NF-κB诱饵寡脱氧核苷酸（ODN）生成的TolDCs负载牛II型胶原（CII），并给予胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠。通过临床和组织学评估关节炎严重程度。采用抗生素介导的菌群清除和粪菌移植（FMT）评估菌群参与情况。还评估了结肠紧密连接蛋白表达、肠系膜淋巴结（MLNs）Treg/Th17平衡、粪便微生物群落、基于16S rRNA测序数据的PICRUSt2预测短链脂肪酸（SCFAs）相关代谢功能、血清SCFAs以及丁酸钠补充的作用。 结果： TolDCs减轻了爪肿胀和关节炎评分，并改善了踝关节病理。在同步抗生素清除实验中，TolDC相关的关节炎结局改善未达到统计学显著性，而来自TolDC处理供体的FMT部分转移了对抗生素预处理的CIA受体的保护作用。TolDC治疗增加了结肠ZO-1和occludin表达，将MLNs中Treg/Th17平衡转向调节性谱型，改变了肠道微生物群落结构和组成，并伴随选定丁酸盐相关MetaCyc通路和KEGG Orthology（KO）功能组的预测丰度升高，以及血清丁酸盐浓度增加。丁酸钠补充部分重现了保护性表型。 结论： 这些发现支持TolDC介导保护中存在菌群依赖性组分，并提示协调的黏膜免疫—肠道菌群—丁酸盐轴可能有助于关节炎控制。

论文解读：耐受性树突状细胞经黏膜免疫—肠道菌群—丁酸盐轴减轻胶原诱导性关节炎

一、研究背景与科学问题

类风湿关节炎（RA）是一种以持续性滑膜炎、系统性免疫失调及进行性软骨和骨破坏为特征的慢性自身免疫性疾病。尽管糖皮质激素和改善病情抗风湿药的应用已显著提升疾病控制水平，仍有相当比例的患者治疗无效或出现需调整或停用治疗的不良反应。因此，恢复免疫耐受而非广泛免疫抑制的策略仍是重要的治疗目标。耐受性树突状细胞（TolDCs）作为一种细胞免疫疗法受到关注，其可限制效应T细胞活化并促进调节性免疫应答。NF-κB诱饵寡脱氧核苷酸（ODN）因NF-κB信号是树突状细胞成熟和T细胞致敏的关键调控因子而被用于生成具有未成熟和耐受性表型的DCs。研究人员前期工作显示NF-κB ODN诱饵诱导的TolDCs可减轻胶原诱导性关节炎（CIA），但超越直接系统性免疫调节的机制仍不清楚。

RA日益被视为一种与黏膜免疫功能障碍和肠道菌群失调密切相关的系统性自身免疫疾病。肠道—关节轴假说认为，上皮屏障完整性受损、微生物群落改变和肠道相关免疫应答失调可促进系统性炎症启动和关节疾病。肠系膜淋巴结（MLNs）是肠道抗原负载树突状细胞向T细胞传递微生物信号并启动和极化T细胞的主要部位，MLNs中Th17/Treg平衡的破坏可能为黏膜免疫失调与自身免疫性关节炎之间提供机制联系。微生物代谢产物，尤其是丁酸盐，通过G蛋白偶联受体信号和组蛋白去乙酰化酶抑制调节上皮屏障完整性、T细胞分化、巨噬细胞功能、细胞因子产生和骨免疫应答。RA和实验性关节炎中已发现SCFA相关细菌丰度改变和丁酸盐可用性降低。树突状细胞处于将微生物信号转化为局部和全身免疫应答的战略位置。研究人员既往观察到过继转移的TolDCs迁移并积聚在CIA大鼠MLNs中，调节免疫检查点表达并降低关节炎严重程度。基于此，本研究检验NF-κB ODN诱饵诱导的TolDCs是否通过黏膜免疫—肠道菌群—丁酸盐轴减轻CIA。

二、研究设计与主要技术方法

研究采用雌性Sprague–Dawley（SD）大鼠（120–140 g），在特定无病原体条件下饲养。CIA诱导采用牛II型胶原（CII）与完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂乳化后皮下注射。主要技术方法包括：从供体大鼠骨髓分离细胞，在白细胞介素-4和粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子存在下培养，并以NF-κB诱饵ODN处理生成TolDCs，第5天负载CII；流式细胞术表征细胞表型；临床和组织学评估关节炎严重程度；免疫组织化学检测结肠紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达；流式细胞术分析MLNs中Treg和Th17细胞；16S rRNA基因V3–V4区测序分析粪便微生物群落，采用DADA2推断扩增子序列变异，PICRUSt2预测SCFA相关代谢功能；液相色谱—电喷雾电离—串联质谱法检测血清SCFAs；抗生素介导菌群清除和粪菌移植（FMT）评估菌群参与；丁酸钠补充实验验证功能贡献。

三、研究结果

NF-κB诱饵ODN处理生成具有未成熟表型的OX-62?树突状细胞。 骨髓来源细胞在NF-κB诱饵ODN存在或不存在条件下分化，两组中超过97%细胞为OX-62?且无组间差异，而TolDC培养物中CD80?和CD86?细胞频率较低，表明生成具有降低共刺激分子表达和未成熟表型的细胞群。

TolDC治疗减轻临床关节炎和关节病理。 CIA大鼠出现进行性爪肿胀和关节炎评分升高。从第28天起，TolDC处理大鼠在指定时间点的平均后踝宽度和总关节炎评分较低。组织学上，TolDC处理关节显示较少炎症和较好结构保存，复合组织病理学评分较低。

抗生素给药减弱TolDC介导的CIA改善。 在同步队列中，TolDC+ABX组较ABX组在爪肿胀、临床关节炎评分和组织病理学评分上数值较低，但差异未达统计学显著性，提示抗生素给药可能减弱TolDCs在CIA大鼠中的治疗效果。另设队列中抗生素治疗显著降低FMT前肠道微生物丰富度和多样性，支持抗生素方案清除肠道菌群的有效性。

来自TolDC处理供体的FMT部分转移保护性表型。 抗生素预处理的CIA受体接受来自未处理CIA供体或TolDC处理CIA供体的粪便。第56天，CIA-FMT受体相对未处理CIA大鼠未改善，而TolDC-FMT受体显示较少爪肿胀、较低后踝宽度和关节炎评分及减轻的关节病理，提供可转移微生物特征贡献于TolDC相关保护的功能性转移证据。

TolDC治疗增加结肠紧密连接蛋白并改变MLN T细胞平衡。 CIA大鼠结肠ZO-1和occludin表达低于对照组，TolDC治疗使两种蛋白均增加。MLNs中，CIA降低CD4?CD25?Foxp3? Tregs频率、增加CD4?IL-17A? Th17细胞并降低Treg/Th17比值，TolDC治疗增加Tregs、减少Th17细胞并提高比值。

TolDC治疗改变粪便微生物多样性和群落结构。 CIA大鼠Shannon指数高于对照组，TolDC治疗相对CIA降低Shannon多样性。Chao1丰富度在对照组和CIA间无差异，但TolDC处理大鼠低于CIA大鼠。Bray–Curtis PCoA显示对照组、CIA和TolDC样本沿PC1和PC2明显分离，ANOSIM确认组间群落结构存在显著整体差异。

TolDC治疗改变门水平和属水平微生物组成。 门水平上，CIA大鼠较对照组显示较低Firmicutes和较高Patescibacteria及Bacteroidota，TolDC组向相反方向转变。Firmicutes-to-Bacteroidota比值在对照组和CIA间无差异，但TolDC处理大鼠高于CIA大鼠。属水平上，TolDC处理大鼠相对CIA大鼠具有较低Candidatus Saccharimonas、未分类Clostridia UCG-014和Streptococcus相对丰度，以及较高Lactobacillus、Romboutsia和Allobaculum相对丰度。

TolDC治疗改变预测的肠道微生物SCFA相关代谢功能和循环SCFA谱。 PICRUSt2预测显示丁酸盐相关通路PWY-5676和CENTFERM-PWY在TolDC处理大鼠中较对照组和CIA组更丰富。KO分析中，丁酸盐相关功能K00626、K00074和K00634在TolDC中高于CIA。靶向血清SCFA谱显示CIA大鼠较对照组异丁酸盐和丁酸盐较低，TolDC治疗相对CIA增加丁酸盐和己酸盐并降低4-甲基戊酸盐。Spearman分析识别出丁酸盐与Lactobacillus和Romboutsia、异戊酸盐与Clostridium sensu stricto 1、己酸盐与Allobaculum的正相关在多重检验校正后仍显著。

丁酸钠部分重现TolDC相关保护性表型。 丁酸钠处理大鼠在第35、42和49天后踝宽度和关节炎评分较低，关节显示较少滑膜增生和炎性细胞浸润及较好结构保存。组织病理学评分低于CIA但高于对照组，表明丁酸钠部分重现了TolDC相关保护性表型。

四、讨论与结论

讨论部分指出，抗生素处理和FMT实验提供互补但非决定性的证据支持肠道菌群对TolDC介导治疗效果的贡献。TolDC治疗在无抗生素暴露的CIA大鼠中减轻关节炎，而抗生素处理下TolDC+ABX组数值上较低但未达统计学显著性。FMT实验显示来自TolDC处理供体的菌群可部分转移保护作用，而来自未处理CIA供体的菌群未产生可比改善。这些实验并未确立肠道菌群为TolDC疗效的唯一决定因素，广谱抗生素可通过菌群依赖和非依赖机制影响宿主生理，FMT转移的是包含活微生物、噬菌体、微生物代谢产物等的复杂粪便生态系统。

结肠和MLNs中观察到的变化提供了TolDC给药与微生物重塑之间合理的免疫学桥梁。CIA相关结肠ZO-1和occludin表达降低，TolDC治疗后两种紧密连接蛋白均增加。TolDC治疗增加MLNs中Tregs频率、减少Th17细胞并提高Treg/Th17比值。MLNs是关键的肠道引流免疫部位，Tregs有助于维持黏膜耐受，Th17细胞促进黏膜炎症并参与RA中滑膜炎和关节破坏。

微生物谱分析显示TolDC治疗改变α多样性和整体群落结构。CIA大鼠较对照组Shannon多样性更高，而TolDC治疗相对CIA降低Shannon多样性和Chao1丰富度，强调更大微生物多样性并非固有有益。F/B比值增加反映治疗相关的群落重组而非简单恢复CIA相关异常。属水平上，TolDC治疗降低CIA富集分类群并增加与碳水化合物利用、SCFA相关代谢状态或肠道免疫调节相关的属。

SCFA发现提供微生物重塑与宿主结局之间探索性的代谢联系。PICRUSt2预测的丁酸盐相关通路和KO丰度升高伴随循环丁酸盐增加，但这些预测源于16S推断，不证明体内基因表达、酶活性或实际微生物SCFA产生。丁酸盐与Lactobacillus或Romboutsia的相关性不确立直接产生关系。丁酸钠干预加强代谢组学发现的功能解释，补充丁酸盐足以改善选定的临床和组织病理学结局，但仅部分重现TolDC相关表型，且未包含丁酸盐耗竭、受体阻断或抗生素加丁酸盐救援实验。

研究局限性包括：TolDC表征主要为表型性，未评估细胞内诱饵ODN持久性和NF-κB抑制动力学及CII反应性T细胞功能；16S rRNA测序缺乏菌株水平分辨率，PICRUSt2预测为功能潜力而非直接测量；靶向血清SCFA分析每组仅五个非溶血大鼠，血清SCFAs不直接测量肠道产生；抗生素实验不排除抗生素对宿主的影响，混合供体FMT限制供体水平推断；连接TolDCs、黏膜免疫、上皮细胞、微生物功能和代谢物的时间序列未解决，内源性丁酸盐对TolDC保护的必要性未测试。

结论为NF-κB诱饵ODN处理的TolDCs减轻实验性关节炎，伴随黏膜免疫平衡、肠道微生物生态、预测丁酸盐相关功能潜力和循环丁酸盐的变化。抗生素暴露期间观察到数值改善但未达统计学显著性，而来自TolDC处理供体的FMT部分转移保护作用。外源性丁酸钠也改善选定关节炎结局。这些发现支持进一步研究相互作用的TolDC—黏膜免疫—菌群—丁酸盐模型，其抗原特异性、细胞稳定性、微生物代谢物产生和直接因果联系仍有待确立。