整合计算与实验方法鉴定抗原特异性抗体

《Frontiers in Immunology》：Integrating computational and experimental approaches to identify antigen–specific antibodies

　　

专业摘要翻译 治疗性抗体的鉴定对于开发多种疾病的有效疗法至关重要。研究人员提出了一种联合计算与实验的方法，用于鉴定抗原特异性抗体。研究人员以一种探针抗原——与白喉毒素A片段（DTA）融合的GFRAL——开发和测试了该流程。利用人源化Trianni小鼠，研究人员进行了一项纵向研究，包括重复采血和脾脏分析。研究人员应用了STAR计算方法，该方法利用关键时间点采集的批量抗体库数据中的相似性网络特性。通过将STAR的输出映射到最后时间点的单细胞数据，研究人员成功鉴定出一组抗体，其中45%表现出结合能力。研究人员观察到趋同选择（convergent selection），即在不同小鼠中发现了具有相同氨基酸互补决定区3（CDR3）的应答序列。研究人员提供了一个包含70种经实验验证的抗GFRAL-DTA融合抗原抗体的目录。本研究强调了整合计算方法与实验验证在治疗性抗体发现中的实用性，能够减少时间并提高效率。

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研究背景与目的

治疗性抗体已成为肿瘤学、免疫学及代谢性疾病等领域的关键治疗手段。传统抗体发现主要依赖体内免疫、体外展示（如噬菌体展示）和计算机模拟三种途径。体内方法虽可获得极高亲和力的抗体，但耗时费力；体外方法虽可规模化筛选，但文库多样性有限，所得抗体亲和力通常较低。现有方法均面临效率与成本之间的权衡。为克服这些局限，本研究旨在整合计算分析与实验验证的优势，开发一种高效的抗原特异性抗体鉴定流程，并以GFRAL-DTA融合蛋白为探针抗原进行验证。

研究方法概述

研究人员采用人源化Trianni小鼠（来自Taconic实验室）进行免疫，在多个时间点采集血液和脾脏样本。关键技术包括：（1）批量B细胞受体（BCR）测序，获取大规模重链CDR3序列；（2）单细胞RNA测序（scRNA-seq），获得配对的轻重链信息；（3）STAR计算方法，基于相似性网络识别统计学上显著的序列簇作为潜在结合物；（4）表面等离子共振（SPR）技术验证抗体的结合能力；（5）AlphaFold 3预测抗体-抗原复合物结构；（6）IgLM模型评估抗体的人源性（困惑度perplexity）及溶解度评分。

研究结果

2.1 实验与计算工作流程鉴定候选GFRAL-DTA特异性抗体

研究人员对3只Trianni小鼠的批量重链免疫球蛋白（IgH）库进行了分析，共获得3,160,880条独特核苷酸序列和1,530,511条独特氨基酸序列。通过STAR方法，研究人员在每个时间点独立分析数据，识别出具有统计显著邻居数的序列簇。最终从STAR输出中匹配到40条存在于单细胞数据集中的序列，成功配对轻重链。

2.2 通过表面等离子共振验证GFRAL-DTA特异性

在40条STAR推荐的序列中，18条被SPR验证为结合物，其中5条具有亚纳摩尔级亲和力。此外，研究人员还基于其他标准测试了更多抗体：单细胞数据中最频繁的32条序列（80%结合成功率）、随机选取的20条单细胞序列（20%成功率）、以及来自相同STAR簇但不同突变水平的154条重建抗体（14%成功率）。总计测试251条序列，70条被确认为结合物。

2.3 GFRAL-DTA抗体的起源与谱系结构

研究人员分析了70条结合物的分布特征，发现其来源于不同小鼠的血液和脾脏。结合物的解离常数（K_D）与其在单细胞数据中的丰度相关性较弱（Spearman ρ=0.26），但与解离速率（k_off）呈强相关（Spearman ρ=0.67）。网络分析显示，结合物与非结合物在序列相似性网络中显著聚集（74%同标签连接，p=3.86×10^-8）。12条结合物在不同小鼠间共享，表明存在趋同选择。

2.4 AlphaFold 3分析实验验证的抗体序列

研究人员利用AlphaFold 3对137条抗体进行结构预测。虽然界面预测对齐误差（ipTM）整体较低，但结合物的平均ipTM值高于非结合物。抗体自身重链与轻链的相对取向预测置信度较高（平均ipTM约0.8），而抗体-抗原相互作用的预测仍不可靠。

2.5 生物物理性质的实验验证

研究人员计算了结合物的困惑度和溶解度评分，并与临床阶段单克隆抗体进行比较。GFRAL-DTA结合物在溶解度方面与参考集重叠，在人源性评分方面处于较低水平，表明其具有良好的可开发性。进一步实验表征显示，10条优选抗体中有9条的质量属性达到或超过预设标准。

讨论与结论

本研究表明，整合计算与实验方法可有效鉴定抗原特异性抗体，提供了70种经验证的抗GFRAL-DTA单克隆抗体（mAbs）目录。然而，该方法仍依赖单细胞数据实现轻重链配对，限制了可扩展性。未来可通过机器学习预测配对或采用新型批量测序技术解决此问题。此外，未使用唯一分子标识符（UMI）可能影响STAR的调用性能。尽管AlphaFold 3在结合预测方面尚不完善，高ipTM值仍可作为结合的良好指标。总体而言，该流程通过从批量库数据中预筛候选物，显著缩短了抗体发现的时间和成本，为加速治疗性抗体的开发提供了新机遇。