性别分层下色素性C57BL/6J小鼠实验性青光眼视网膜神经炎症与神经变性及西司他丁（cilastatin）的神经保护作用

《Frontiers in Neuroanatomy》：Retinal neuroinflammation and neurodegeneration in a mouse model of glaucoma: cilastatin as a protective agent in male and female mice

　　

背景：青光眼是导致不可逆失明的主要原因，特征为视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）变性和神经炎症。尽管已有研究报道青光眼存在性别相关差异，但多数实验研究主要使用雄性动物。本研究评估雄性及雌性色素性C57BL/6J小鼠对实验性青光眼的视网膜反应以及西司他丁（cilastatin）的神经保护作用。方法：研究人员通过单侧左眼激光光凝在雄性及雌性C57BL/6J小鼠中诱导眼压升高（ocular hypertension，OHT）。动物自手术前2天起每日接受西司他丁（300 mg/kg，i.p.）或溶媒，直至第28天处死。研究全程监测眼内压（intraocular pressure，IOP）。采用免疫组织化学和定量图像分析评估Brn3a⁺（脑特异性同源盒/POU域蛋白3A）RGCs、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）⁺大胶质细胞和离子化钙结合适配分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba-1）⁺小胶质细胞。在雄性和雌性及不同治疗组中比较OHT眼、眼压正常对侧眼（contralateral，CONTRA）和未处理（NA?VE）眼。结果：OHT在雄性和雌性中均升高IOP，并与雄性和雌性小鼠Brn3a⁺ RGCs减少相关。在性别分层分析中，区域和层特异性评估显示视网膜炎症具有不同的描述性空间模式，雄性队列和雌性队列观察到不同的小胶质细胞和大胶质细胞反应谱。西司他丁未产生持续降IOP效应，但在两性中显著减轻OHT相关Brn3a⁺ RGCs减少并降低胶质激活。结论：实验性青光眼在色素性C57BL/6J小鼠中诱导神经退行性和神经炎症性视网膜反应，两性间观察到不同的描述性空间模式。西司他丁减轻OHT相关Brn3a⁺ RGC计数下降和胶质激活，而未产生持续降IOP效应，支持进一步研究其在青光眼中的潜在相关性。

青光眼是导致不可逆失明的主要原因，预计2040年全球受累人数达1.11亿。原发性开角型青光眼（primary open-angle glaucoma，POAG）因房水外流受损导致眼压升高（ocular hypertension，OHT），进而引起视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）变性和不可逆视力丧失。OHT是主要可调控危险因素，降低眼内压（intraocular pressure，IOP）是当前治疗核心；但即使IOP受控仍存在视力丧失，且正常眼压性青光眼存在，提示神经炎症等额外机制参与。视网膜神经炎症已成为青光眼损伤的重要因素：小胶质细胞和大胶质细胞持续或失调激活可转向促炎表型，加速RGCs变性。另一方面，生物性别对疾病易感性和进展的影响仍未充分解决；雌性在临床前研究中代表性不足，且不同小鼠模型和诱导方式下性别差异表现不一。前期研究显示西司他丁（cilastatin，CIL）在雄性Swiss CD1小鼠实验性青光眼中具有抗炎和神经保护作用，但仅限于雄性白化小鼠；由于性别特异性免疫反应及品系依赖性IOP调节、胶质反应和RGCs脆弱性可影响药效，需在雌雄及色素性C57BL/6J小鼠中验证。因此，本研究旨在评估实验性青光眼在雄雌色素性C57BL/6J小鼠中的视网膜反应及CIL的神经保护作用。研究得出：激光诱导OHT在雄雌中升高IOP，并导致Brn3a⁺ RGCs减少和胶质激活；两性存在不同的描述性空间模式；CIL不持续降低IOP，但减轻OHT相关RGCs减少和胶质激活。其意义在于将CIL的保护证据扩展至雌雄和色素性品系，并强调在临床前青光眼研究中将性别作为生物学变量。

方法概述（不超过250字）：作者使用购自Charles River Laboratories（Les Oncins，France）的C57BL/6J雄雌小鼠，采用左眼单侧532 nm激光光凝诱导OHT，右眼为CONTRA，并设NA?VE对照。CIL（300 mg/kg，i.p.）或溶媒（vehicle，VH）自术前2天每日给药至术后28天。关键方法包括：TonoLab回弹眼压计在基线及术后多个时间点监测IOP，并分析峰值IOP和曲线下面积（area under the curve，AUC）；免疫组织化学检测Brn3a⁺ RGCs、GFAP⁺大胶质细胞和Iba-1⁺小胶质细胞；按视网膜九区域及层特异性进行定量图像分析；采用性别分层混合效应模型统计。样本来源已注明。

3.1 眼压测量（Intraocular pressure measurements）：通过纵向IOP测量及峰值IOP和AUC分析，OHT眼在雄雌中均显著高于NA?VE和CONTRA眼，模型成功诱导OHT；雌性峰值IOP相对升高幅度高于雄性（约163.70% vs 103.23%），但总体峰值和累积高眼压负荷在性别间具有可比性；雄性早期峰值明显，雌性升高持续时间更长（第7天仍可见）；CIL未产生持续降IOP效应。3.2 视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells）：通过Brn3a⁺免疫组化计数全视网膜及九区域，OHT+VH眼RGCs显著减少（雄性约57.21%，雌性约76.16%）；雌性CONTRA+VH眼也较NA?VE+VH减少；CIL显著抵消OHT所致减少（雄性和雌性）。区域分析显示损伤和CIL保护具有区域异质性，雄性C-C、T-S等区域，雌性N-C、T-C等区域；CIL在部分区域使Brn3a⁺水平接近NA?VE。3.3 大胶质细胞（Macroglial cells）：通过GFAP⁺免疫反应光密度定量全视网膜、内/外视网膜及九区域，OHT增加GFAP⁺表达（雄性约88.30%，雌性约94.69%），主要累及内视网膜；雌性OHT+VH眼GFAP高于NA?VE+VH和CONTRA+VH，CIL降低雌性OHT眼GFAP；区域模式在雄雌不同，雄性呈手术主效应，CIL在部分区域降低GFAP。3.4 小胶质细胞（Microglial cells）：通过Iba-1⁺细胞计数、层特异分析和形态分型，OHT增加Iba-1⁺细胞（雄性约128.57%，雌性约53.00%），视神经纤维层/神经节细胞层（optic nerve fiber layer/ganglion cell layer，ONFL/GCL）两性均增加，雄性扩展至内核层（inner nuclear layer，INL）和外丛状层（outer plexiform layer，OPL），内丛状层（inner plexiform layer，IPL）两性OHT+VH增加且CIL降低；区域模式性别不同；雄性OHT眼水平迁移型（horizontal，HZ）比例升高、放射型（radial，RD）比例降低，雌性NA?VE+CIL HZ降低/RD升高；阿米巴样仅见于3只雄性OHT+VH，占比<1%。CIL在部分区域和IPL降低小胶质细胞计数。

讨论总结：本研究首次在雄雌色素性C57BL/6J小鼠中长期（28天）综合评估实验性青光眼细胞反应，并提供CIL抗炎/神经保护证据。OHT后IOP约1周恢复，但RGCs仍减少；雌性CONTRA眼RGCs减少提示单侧模型对侧眼不应视为真正对照。区域分析显示损伤靠近视乳头区域更易受累；GFAP增加主要在内层，色素鼠较白化鼠受限；小胶质细胞反应存在性别空间差异。CIL不持续降IOP，其保护独立于IOP。原文基于既往文献提出CIL可能通过二肽酶-I（dehydropeptidase-I，DHP-I）抑制、Fas/Fas配体、Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核因子κB（NF-κB）、NOD样受体家族pyrin域蛋白3（NLRP3）、megalin和有机阴离子转运体（organic anion transporters，OATs）等通路发挥作用，但未在本研究直接验证，应视为假说性解释。局限性包括单时间点组织学、无分子机制、预防性给药、未测性激素、Brn3a⁺计数不能等同于RGC存活、无功能评估。研究结论翻译：实验性青光眼在色素性C57BL/6J小鼠中诱导神经退行性和神经炎症性视网膜反应，两性间观察到不同的描述性空间模式。西司他丁减轻OHT相关Brn3a⁺ RGC计数下降和胶质激活，而未产生持续降IOP效应，支持进一步研究其在青光眼中的潜在相关性。