《Frontiers in Bioinformatics》：Mutational binding assessment for TCR engineering on experimental and AlphaFold 3 scaffolds
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基于机器学习的结合亲和力预测可支持T细胞受体（T-cell receptor，TCR）工程，但当TCR与肽-主要组织相容性复合体（peptide–major histocompatibility complex，pMHC）结合的实验结构不可用而必须使用预测结构
基于机器学习的结合亲和力预测可支持T细胞受体（T-cell receptor，TCR）工程，但当TCR与肽-主要组织相容性复合体（peptide–major histocompatibility complex，pMHC）结合的实验结构不可用而必须使用预测结构时，其可靠性仍不确定。本研究考察了AlphaFold 3（AF3）支架选择与构象采样如何影响基于ΔΔG的TCR–pMHC互补决定区（complementarity-determining region，CDR）突变优先级排序。结合-未结合结构比较显示，pMHC结合主要与局部CDR重塑相关，尤其是CDR3环，而TCR框架区相对稳定。AF3总体上恢复了结合样TCR构象，但下游ΔΔG预测性能强烈依赖于支架来源与模型架构。这些支架依赖性差异表明，实验结构在可用时仍是最可靠的输入，尽管在前瞻性TCR设计场景中此类结构通常难以获取。在基于AF3的输入中，Prompt-DDG与RDE-PPI对野生型预测支架相对稳健，而BA-DDG与H3-DDG则更多受益于通过反向突变评分评估的突变特异性AF3支架。在四种模板中，AF3突变支架在所有四种预测器中均给出最高的平均前10恢复率。这些结果支持在可用时使用实验结构，并建议在仅有预测结构时使用AF3突变支架以恢复排名靠前的CDR候选。
研究背景与问题
近年来，基于机器学习的蛋白质设计方法取得了飞速进展。基于扩散的骨架生成器如RFdiffusion，结合ProteinMPNN等深度学习序列设计工具，已能针对多样靶点设计微型蛋白结合子，相关扩展现已支持原子级分辨率的抗体设计。在蛋白质结构预测领域，AlphaFold蛋白质结构数据库极大扩展了已知蛋白质序列空间的结构覆盖度，而AlphaFold 3进一步将结构预测从单一蛋白质扩展到生物分子复合物，包括蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸和蛋白质-配体组装体。这些进展使得为感兴趣靶点生成成百上千个候选结合子成为可能。然而，通过表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）等生物物理实验验证结合亲和力仍属劳动密集型工作，需要专门技术和昂贵设备，且难以扩展到大型设计文库。因此，按预测结合强度对候选进行优先排序的计算方法正成为蛋白质设计工作流程中日益重要的组成部分。
抗体和T细胞受体（TCR）工程是候选优先排序依赖蛋白质-蛋白质识别精确建模的重要应用领域。抗体和TCR均为异二聚体免疫受体，其抗原结合位点由互补决定区（CDR）形成。TCR通常由TCRα和TCRβ链组成，其可变域各贡献三个CDR环；这些环共同识别由主要组织相容性复合体分子呈递的抗原肽，统称为肽-MHC（pMHC）。在这些环中，CDR3α和CDR3β序列变异性高，且在抗原结合过程中可发生显著构象变化。在抗体-抗原和TCR-pMHC识别中，局部序列优化通常以预测的突变诱导结合自由能变化ΔΔG为指导。一系列基于结构的深度学习模型已开发用于此任务，包括RDE-PPI、Prompt-DDG、BA-DDG和H3-DDG。这些方法使用模板复合物结构（通常为野生型结构）结合突变信息预测ΔΔG，因此不假设突变复合物结构实验可得。
尽管取得上述进展，当前训练与评估体系中两个假设限制了ΔΔG预测器在设计阶段的应用信心。第一，大多数基准提供实验野生型复合物结构作为模型输入；然而在许多设计问题中，相关复合物没有晶体学参考结构。新表征的靶点、研究较少的复合物工程变体以及从头设计结合子往往仅有AlphaFold 3或相关模型的预测结构。因此，在实验结构上观察到的ΔΔG预测性能是否能迁移到预测结构尚不清楚。第二，大多数模型对每个复合物仅评分单一静态构象；而SPR等生物物理测量反映的是构象系综的平衡结合性质，单一结构预测可能对输入构象敏感。
研究内容与意义
本研究系统考察了预测结构与系综输入选择如何影响TCR-pMHC结合中的ΔΔG预测，做出四项贡献。第一，量化30对匹配的TCR结合/未结合对中pMHC结合引起的CDR构象变化，显示CDR3环和界面侧链位移最大而框架区相对稳定。第二，在Cα、全重原子、侧链、界面和残基分辨率水平上将AlphaFold Server预测与相同实验结构进行基准比较。第三，在精选的ATLAS突变集上，使用实验PDB结构、单个AlphaFold预测野生型结构、单个AlphaFold预测突变结构和AlphaFold预测构象系综评估四种最先进的基于结构的ΔΔG预测器，并以无结构输入的纯序列基线作为对照。第四，量化预测不确定性，评估突变系综大小对性能的影响，并在四个具有至少20个合格CDR变体的TCR-pMHC模板上比较CDR候选优先排序。
关键技术方法
研究人员从ATLAS数据库精选了438个具有实验测量ΔΔG值的突变条目，涵盖37个独特的TCR-pMHC复合物，均具有解析的三维结构。使用TCRFlexDock基准中的30对匹配结合/未结合TCR对量化CDR构象变化。通过AlphaFold Server生成预测结构，包括野生型单结构、突变体单结构以及20个结构的构象系综。评估四种基于结构的ΔΔG预测器：RDE-PPI（通过估计旋转异构体分布和熵建模侧链构象灵活性）、Prompt-DDG（通过层级提示编码突变中心微环境）、BA-DDG（基于逆折叠序列似然的热力学循环）、H3-DDG（扩展逆折叠建模与层级多体注意力）。以PPAC纯序列预测器作为无结构输入的参考基线。
研究结果
2.1 pMHC结合引起的CDR构象变化
通过30对匹配的结合/未结合TCR对的Cα RMSD分析，框架区RMSD低（0.86±0.24 ?），确认TCR免疫球蛋白支架在结合与未结合状态间基本保守。CDR区域RMSD较高（1.77±0.56 ?），表明pMHC结合主要与抗原识别环的局部重塑相关。CDR3环位移最大：CDR3α为2.22±1.23 ?，CDR3β为1.69±0.74 ?。CDR1和CDR2变化较小，α链环较β链对应环更具移动性。全重原子和侧链分析确认相同模式，界面侧链RMSD平均达3.13±1.00 ?，残基级剖面将最大位移定位至CDR3区域。
2.2 AlphaFold Server捕获结合样TCR-pMHC复合物结构
AlphaFold Server在多数情况下以高精度重现TCR区域。框架区Cα RMSD为0.78±0.25 ?，与实验结合-未结合框架RMSD 0.86±0.24 ?相当。预测CDR构象比相应未结合实验构象更接近实验结合结构：CDR总RMSD为0.86±0.47 ?，而结合-未结合为1.77±0.56 ?；CDR3α从2.22降至0.95 ?，CDR3β从1.69降至0.72 ?。全重原子和侧链分析同样显示AF3预测更接近实验结合CDR几何。然而预测质量并非均匀：全复合物Cα RMSD范围为0.73至4.46 ?，表明部分系统中TCR-pMHC对接几何仍具挑战。
2.3 结构输入选择与模型选择共同决定ΔΔG预测精度
实验野生型PDB结构为所有四种模型提供最佳输入：RDE-PPI r=0.840，Prompt-DDG r=0.822，BA-DDG r=0.826，H3-DDG r=0.795。用AF3预测野生型支架替换实验结构时，Prompt-DDG最稳健（r从0.822降至0.796），RDE-PPI紧随其后（r=0.786）；BA-DDG降至0.658，H3-DDG降至0.551。使用AF3突变支架并通过反向突变评分时，BA-DDG升至0.669，H3-DDG升至0.729。AF3系综聚合具有模型和支架依赖效应：算术均值聚合在AF3突变支架上将RDE-PPI从0.734提至0.746，Prompt-DDG从0.756提至0.760；在AF3野生型支架上将Prompt-DDG从0.796提至0.800，而BA-DDG从0.658降至0.637。饱和分析显示将突变系综从20增至100个结构无一致改善。纯序列PPAC参考r=0.504，RMSE=1.949 kcal/mol，MAE=1.205 kcal/mol。
讨论与结论
研究结果表明，实验结构在可用时仍是最可靠的ΔΔG预测输入。在仅能获得预测结构的前瞻性TCR设计场景中，AF3突变支架在所有四种预测器上均给出最高的平均前10恢复率，建议将其用于恢复排名靠前的CDR候选。Prompt-DDG和RDE-PPI对野生型预测支架相对稳健，而BA-DDG和H3-DDG更多受益于突变特异性AF3支架。AF3预测的CDR构象通常接近实验结合结构，但残余的1-2 ?误差对几何敏感的ΔΔG预测器仍具相关性。使用超过20个突变特异性AF3结构未改善预测性能。这些发现为TCR工程中ΔΔG预测器的输入结构选择提供了实证指导。
