# 嗜盐古菌 *Halorhabdus rudnickae* 增强Calu-3细胞上皮屏障完整性及其在过敏性气道疾病中的潜在免疫调节意义

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Halophilic archaeon Halorhabdus rudnickae enhances epithelial barrier integrity in Calu-3 cells

　　

嗜盐古菌（halophilic archaea）是独立于细菌（Bacteria）与真核生物（Eukarya）的一个独特生命域，可在包括盐矿在内的高盐环境中繁衍。其对人类免疫系统的影响迄今知之甚少。呼吸道上皮是抵御吸入性环境因子（包括污染物、过敏原与微生物）的第一道防线。上皮屏障完整性的破坏与过敏性和炎症性气道疾病的发病机制相关。本研究考察了分离自波兰维利奇卡盐矿（Wieliczka Salt-Mine）Barycz矿区的嗜盐古菌 *Halorhabdus rudnickae* WSM-64^T与人文气管上皮细胞系Calu-3的相互作用。研究发现，该嗜盐古菌菌株对Calu-3细胞不产生细胞毒性（cytotoxic）或基因毒性（genotoxic）效应，且与未刺激细胞相比可显著促进物理损伤细胞单层的愈合过程。此外，嗜盐古菌对Calu-3的刺激与闭锁小带蛋白-1（ZO-1，负责组织连接蛋白并稳定细胞屏障的支架蛋白）荧光强度的显著升高相关。暴露于 *Hrd. rudnickae* 可显著降低Calu-3细胞对转化生长因子-β（TGF-beta）的分泌，提示其具有对抗TGF-beta驱动病理变化的潜在能力。在气液界面（air-liquid interface, ALI）模型中，观察到FITC-葡聚糖通透性显著降低，表明嗜盐古菌刺激Calu-3后屏障完整性得到改善。因此，研究结果表明，分离自波兰盐矿的嗜盐古菌 *Hrd. rudnickae* 可诱导Calu-3细胞上皮屏障完整性的增强，为肺部过敏性疾病患者的未来免疫调节策略提供了概念框架。

**研究背景与科学问题**

呼吸道上皮细胞属于非造血细胞，在协调宿主免疫应答中承担关键作用，其与外界环境持续接触，是分隔机体内环境与外部威胁的主要屏障。功能良好的上皮屏障由三部分构成：纤毛与黏液（清除物理性威胁）、细胞间紧密连接与黏附连接（调控物质的细胞旁转运）以及抗菌因子（杀伤吸入性病原体）。近年来，"上皮屏障假说"被提出，其依据是特应性皮炎、哮喘、过敏性鼻炎、炎症性肠病及乳糜泻等多种慢性疾病中均可见上皮屏障损伤；上皮细胞损伤与屏障完整性破坏、警报素（alarmins，如IL-25、IL-33、TSLP）释放及炎症发生相关联，而炎症又进一步破坏屏障，导致有害环境因子向组织内渗透。臭氧、二氧化氮、加工食品中的表面活性剂或乳化剂、屋尘螨与花粉过敏原以及细胞因子（包括IL-4与IL-13）等多种因素均可损害上皮屏障结构，其机制涉及紧密连接（tight junctions, TJs）表达受损与降解、活性氧（ROS）对细胞结构的氧化、炎症诱导及细胞死亡通路激活。迄今尚无被证实具有上皮屏障再生潜力的药物制剂，因此寻找新型促再生因子（包括利用分泌治疗性代谢物的微生物）的研究持续进行。

古菌为三大生命域之一，与细菌和真核生物显著不同，常被视为可在极端不利条件（低/高pH、低/高温度、高盐或重金属存在）下存活的嗜极微生物，被认为具有生物技术与医学潜力。嗜盐古菌栖息于卤水、岩盐、盐湖与盐矿等高盐环境，目前尚未发现可被视为直接人类病原体的嗜盐古菌物种。研究人员此前在博赫尼亚盐矿（Bochnia Salt Mine）鉴定了空气传播的嗜盐古菌，并发现其随物理化学条件变化而呈季节波动与变异性。既往研究还显示，*Hrd. rudnickae* 与 *Natrinema salaciae* 两株嗜盐古菌可进入人单核细胞来源树突状细胞（DCs），刺激表面受体CD83、CD86、CD80表达，促进DCs及自体T淋巴细胞产生细胞因子，且未观察到凋亡/坏死效应；此外还描述了嗜盐古菌对金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）所致DNA损伤的保护作用。然而，嗜盐古菌与上皮细胞的相互作用仍知之甚少。为此，研究人员以Calu-3细胞系为体外模型，考察分离自波兰维利奇卡盐矿Barycz矿区（Albuquerque et al., 2016）的 *Hrd. rudnickae* WSM-64^T（= DSM 29498^T；= CECT 8673^T）与人上皮细胞的相互作用。

**主要技术方法**

研究采用人气道上皮细胞系Calu-3（购自LGC Standards，ATCC-HTB-55），按Braakhuis等（2020）方案培养，实验使用第8–20代细胞；嗜盐古菌 *Hrd. rudnickae*（WSM-64^T=DSM29498^T）由葡萄牙坎塔涅迪Biocant Park的Luciana Albuquerque博士惠赠，于HBM液体培养基中培养48小时、取对数生长期菌体，按感染复数（MOI）10进行刺激。关键技术包括：CCK-8法细胞活力检测；碱性彗星试验（comet assay）检测DNA损伤；划痕试验（wound healing assay）结合xCELLigence RTCA eSight实时细胞分析系统（每2小时采集，持续72小时）评价细胞迁移/增殖；共聚焦显微镜免疫荧光检测ZO-1；ELISA检测TGF-beta、IL-6与TNF-alpha分泌；气液界面（ALI）培养模型结合跨上皮电阻（TEER）测定与FITC-葡聚糖旁细胞通量检测；以及鬼笔环肽（phalloidin）肌动蛋白染色观察ALI培养结构。统计采用GraphPad Prism 8.1与STATISTICA 12.0，经Kolmogorov-Smirnov正态性检验后使用非参数检验（多组比较用Kruskal-Wallis检验，两组比较用Mann-Whitney U检验），p ≤ 0.05为显著。

**研究结果**

**Hrd. rudnickae 不诱导Calu-3细胞系的细胞毒性或可检测的DNA损伤**：Calu-3细胞经 *Hrd. rudnickae* 刺激24与48小时后，CCK-8法显示其活力与未刺激细胞无显著差异，而10% DMSO阳性对照活力显著降低（p = 0.0022）。碱性彗星试验中，刺激24与48小时后尾DNA百分比（% tail DNA）无显著变化，证实无基因毒性效应；阳性对照TBH（50 μM）在24小时（p = 0.0286）与48小时（p = 0.0286）显著增加DNA损伤。

**Calu-3细胞对 *Hrd. rudnickae* 刺激的细胞因子产生**：收集刺激24与48小时后的培养上清，检测IL-6、TNF-alpha与TGF-beta水平。所测分析物中仅TGF-beta可被检出，且其水平在24小时（p = 0.0079）与48小时（p = 0.0079）均显著低于未刺激细胞；培养上清中未检测到IL-6与TNF-alpha产生。

**Hrd. rudnickae 诱导Calu-3单层细胞伤口愈合**：以AccuWound 96工具物理损伤Calu-3单层后给予嗜盐古菌刺激，用xCELLigence RTCA eSight每2小时间隔观察迁移达72小时。*Hrd. rudnickae* 刺激的Calu-3细胞在24、48与72小时的伤口覆盖率均显著高于未刺激细胞：24小时为27.96 ± 2.11%对21.35 ± 2.41%（绝对差+6.61个百分点，相对+30.96%，p = 0.0086）；48小时为38.15 ± 1.36%对29.91 ± 3.32%（Δ = +8.23个百分点；+27.53%；p = 0.0014）；72小时为41.89 ± 0.62%对34.05 ± 4.18%（Δ = +7.85个百分点；+23.05%；p = 0.0021）。持续暴露使伤口内汇合百分比面积呈时间依赖性升高，各时间点处理组均持续高于对照约6.6–8.2个百分点，相对优势在实验早期最大，随单层接近更高汇合度而逐步下降。

**嗜盐古菌增加ZO-1蛋白荧光强度**：通过ZO-1免疫荧光染色结合共聚焦显微镜检测紧密连接变化，以IFN-gamma（50 ng/mL）作为破坏因子。*Hrd. rudnickae* 刺激的Calu-3细胞在48小时（p = 0.0152）与72小时（p = 0.0043）的ZO-1荧光信号显著高于未刺激细胞；且在24小时（p = 0.0006）、48小时（p = 0.0022）与72小时（p = 0.0022）显著高于IFN-gamma刺激细胞。IFN-gamma则在24小时（p = 0.0041）、48小时（p = 0.0411）与72小时（p = 0.0022）显著低于未刺激细胞。

**Hrd. rudnickae 降低Calu-3 ALI培养中的FITC-葡聚糖通量**：以鬼笔环肽染色观察插入膜上ALI培养结构，并进行TEER与FITC-葡聚糖旁细胞通量测定。TEER结果显示，IFN-gamma（50 ng/mL）刺激的ALI培养在48小时（p = 0.0433）与72小时（p = 0.0152）显著低于0小时未刺激细胞；未刺激与 *Hrd. rudnickae* 刺激的ALI培养之间TEER无显著变化。FITC-葡聚糖试验显示，*Hrd. rudnickae* 刺激的Calu-3细胞在48小时（p = 0.0022）基底侧c-MEM样本中FITC-葡聚糖荧光显著低于未刺激细胞，72小时则无此差异；IFN-gamma刺激细胞在48小时（p = 0.0022）与72小时（p = 0.0022）显著高于 *Hrd. rudnickae* 刺激细胞，且较未刺激细胞在48小时（p = 0.0173）与72小时（p = 0.0022）显著升高，表明屏障渗漏增加。

**讨论与结论**

讨论指出，本研究据其所知是首次探究嗜盐古菌与上呼吸道上皮相互作用的工作。盐矿空气中存在空气传播的嗜盐古菌，提示其可能与患者及游客的上呼吸道上皮细胞发生相互作用。既往增强上皮屏障的尝试多集中于细菌：*Akkermansia muciniphila*、*Lactobacillus plantarum* MB452及多种 *Bifidobacterium bifidum* 菌株可改善小鼠肠道屏障完整性、在Caco-2模型中上调紧密连接基因表达或提高TEER；在上呼吸道，DiGuilio等（2023）用槲皮素刺激Calu-3单层显示屏障强化作用，Martens等（2018b）及Kleniewska与Pawliczak（2024）则讨论了益生菌对过敏性鼻炎、慢性鼻窦炎及哮喘等呼吸疾病的影响。古菌域研究此前主要集中于产甲烷古菌（如 *Methanobrevibacter smithii*、*Methanosphaera stadtmanae*）：Blais Lecours等（2011）在小鼠模型中发现鼻内给予产甲烷古菌引起肺部组织学改变、免疫细胞浸润及剂量依赖性抗原特异性IgG产生，但未考察上皮屏障结构；Bang等（2014）发现Caco-2/BBe细胞不识别产甲烷古菌，无IL-8产生，TNF-α、IL-8、HBD1、HBD4、HD6与LL37等基因转录亦无变化；Weinberger等（2025）显示产甲烷古菌来源胞外囊泡刺激HT-29细胞产生高水平CX3CL1，仅 *M. intestini* 来源囊泡诱导高IL-8，且对HT-29与THP-1细胞无细胞毒性，这与研究人员此前关于嗜盐古菌的发现一致。本研究无细胞毒性与基因毒性的结果与既往嗜盐古菌对A549细胞系无毒性作用的报道相符。研究人员既往已证明 *Hrd. rudnickae* 与 *N. salaciae* 可诱导DCs及DCs与自体CD4⁺ T淋巴细胞共培养产生细胞因子，本研究中Calu-3细胞受刺激后TGF-beta产生显著减少；TGF-beta为参与细胞增殖、分化、胚胎发育、伤口愈合、免疫调节、组织纤维化与肿瘤发生等多过程的多功能细胞因子，并参与上皮–间充质转化（EMT），亦为肺纤维化关键介质，靶向TGF-beta信号通路（中和抗体、小分子抑制剂、配体陷阱、反义寡核苷酸、疫苗）正在临床前与临床试验中测试。鉴于Buckley等（2010）报道Calu-3细胞受TGF-beta刺激后形态、E-cadherin与vimentin表达及伤口愈合速率无明显变化，而A549细胞则出现EMT样改变，提示细胞系对TGF-beta反应存在差异且不能直接外推至原代细胞；本研究中Calu-3的增殖和/或迁移似不依赖TGF-beta自分泌作用。嗜盐古菌加速伤口愈合的机制尚未阐明，或与许多嗜盐古菌的重要代谢物类胡萝卜素有关——*Kocuria* sp. RAM1中的类胡萝卜素在HSF与OEC细胞系中显示类似促愈合效应，但该推测仍需进一步研究。关于紧密连接，ZO-1可与claudins、occludin、ZO-2、ZO-3、cingulin、afadin、JAM-A、α-catenin等多种蛋白结合；上皮细胞培养中同时缺失ZO-1与ZO-2会损害claudins募集、显著削弱屏障功能，且缺乏ZO-1的上皮细胞在伤口愈合中启动有效增殖的能力显著受损。ALI模型中 *Hrd. rudnickae* 仅在48小时而非72小时显著降低FITC-葡聚糖通透性，后续研究应考虑更广的时间点范围；TEER无统计学显著变化，而IFN-gamma作为破坏因子引起的ZO-1荧光降低、TEER下降与FITC-葡聚糖通透性升高与文献一致。作者同时指出研究局限：一是嗜盐古菌与上皮细胞相互作用的机制尚不清楚，其是否类似产甲烷古菌经RNA及TLR8依赖性NLRP3炎症小体活化通路激活免疫系统仍有待研究；二是研究仅聚焦Calu-3细胞系，未考察原代上呼吸道上皮细胞，鉴于Calu-3细胞可能与新鲜分离的原代鼻上皮细胞存在差异（Martens et al., 2018a），未来宜在原代上皮细胞中扩展研究。

结论部分译文如下：综上所述，本研究证明，嗜盐古菌 *Hrd. rudnickae* 刺激Calu-3细胞不诱导上皮细胞的毒性或基因毒性，改善物理性伤口愈合过程，并降低Calu-3细胞TGF-beta的产生。此外，嗜盐古菌增强了上皮屏障，表现为ZO-1荧光强度升高与FITC-葡聚糖通透性降低。围绕上皮屏障开展嗜盐古菌研究仍处于起步阶段，尚需进一步研究以明确嗜盐古菌与上皮细胞相互作用的机制。尽管如此，研究人员认为嗜盐古菌未来可能在以屏障受损为特征的疾病治疗中具有应用潜力。