《Frontiers in Veterinary Science》：Qingqiao polyphenols may alleviate multi-organ inflammatory injury caused by Escherichia coli infection in chickens by regulating pyroptosis in a gut microbiota-independent manner
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背景： 本研究系统阐明了青翘多酚（Qingqiao polyphenols, QP）通过调控细胞焦亡信号通路减轻家禽细菌感染性病变的作用机制。
方法： 研究人员建立了一个大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）O157感染模型，并评估
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背景： 本研究系统阐明了青翘多酚（Qingqiao polyphenols, QP）通过调控细胞焦亡信号通路减轻家禽细菌感染性病变的作用机制。
方法： 研究人员建立了一个大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）O157感染模型，并评估了QP对感染鸡只的影响。
结果： 结果显示，QP显著缓解了感染引起的全身性损伤，表现为肝脏和肺脏病理学病变改善，以及十二指肠、空肠和回肠黏膜结构恢复。进一步研究表明，QP通过抑制细胞焦亡信号通路，减轻了由E. coli诱导的鸡只肝脏、肺脏和肠道（十二指肠、空肠、回肠）的炎性损伤。在使用抗生素清除肠道微生物后，研究人员利用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的鸡肠炎模型评估了QP是否能够通过抑制细胞焦亡通路发挥抗炎作用。结果表明，即使在抗生素清除微生物组的条件下，QP仍能有效抑制细胞焦亡并缓解LPS诱导的肠道炎症。这表明，QP的抗炎作用可能通过一条独立于肠道微生物群的细胞焦亡通路介导。
结论： 本研究证实，QP通过一种不依赖于肠道微生物群的细胞焦亡抑制机制，对E. coli诱导的炎性损伤发挥多器官保护作用，这为QP作为抗生素替代品在家禽细菌性疾病防控中的应用提供了新的理论基础。
一、研究背景与目的
细菌性传染病严重制约着家禽养殖业的健康发展，其中由大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）感染引起的肠炎和全身性病变尤为突出。其外膜的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是诱导宿主产生严重炎症反应的关键毒力因子。在细菌感染的病理过程中，细胞焦亡是一种重要的程序性细胞死亡方式，会显著加剧组织损伤。其典型途径是NLRP3炎症小体识别病原相关分子模式后组装，招募接头蛋白ASC形成复合物，进而激活Caspase-1。活化的Caspase-1一方面切割Gasdermin D（GSDMD）形成细胞膜孔道导致细胞焦亡，另一方面促进促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟与分泌，从而放大炎症级联反应。由于抗生素的过度使用导致耐药性问题日益严峻，亟需开发新型兽药。中药连翘的干燥幼果“青翘”被认为药用价值更高，从中提取的青翘多酚（Qingqiao polyphenols, QP）含有连翘酯苷A、连翘苷和连翘脂素等多种活性成分，已被证明具有抗炎、抗氧化和抗菌等药理作用。尽管QP在哺乳动物模型中显示出抗炎和抗氧化活性，但其对家禽细菌感染的保护作用和机制尚不清楚。因此，本研究旨在从细胞焦亡的角度探讨QP缓解E. coli感染所致全身性损伤的效果及其机制，为开发新型抗家禽细菌感染药物提供理论依据。
二、研究方法
研究人员采用超声辅助提取结合D101大孔树脂吸附纯化技术从青翘中获得QP，并采用Folin-Ciocalteu法测定其多酚含量。实验动物选用1日龄京红蛋鸡，所有动物实验方案经河南科技学院动物实验伦理审查委员会批准。研究分为两部分：（1）将90只雏鸡随机分为空白对照组、E. coli O157模型组、0.4 g/kg QP组、0.8 g/kg QP组、1.6 g/kg QP组和恩诺沙星阳性对照组，通过腹腔注射建立E. coli感染模型；（2）另取60只雏鸡随机分为正常对照组、LPS模型组、QP处理（完整菌群）组和QP处理（菌群近清除）组，通过饮水中添加广谱抗生素混合物清除肠道共生菌，并腹腔注射LPS建立肠炎模型。研究采用了预接种打孔法和肉汤微量稀释法进行体外抗菌活性评估；通过平板计数法检测组织细菌载量；利用苏木精-伊红染色进行组织病理学分析；使用商品化试剂盒检测血清中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）和乳酸脱氢酶（LDH）水平；运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞焦亡相关基因mRNA表达；采用免疫印迹法检测相关蛋白表达水平。
三、研究结果
3.1 QP的体外抗菌活性：通过预接种打孔法和肉汤微量稀释法评估，结果显示浓度为175 mg/mL的QP对E. coli形成了13 mm的抑菌圈，最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）均为43.75 mg/mL，表明QP具有直接的抑菌和杀菌活性。
3.2 QP对感染雏鸡体重、脏器指数和脏器载菌量的影响：E. coli感染显著抑制雏鸡增重，导致肝、脾、心和肺的脏器指数显著升高，而胸腺和法氏囊指数显著降低。QP干预显著改善了这些组织损伤和免疫器官萎缩。平板计数分析显示，QP处理后各脏器的E. coli定植量均显著减少，其中高剂量QP预处理效果最显著，与阳性对照药物恩诺沙星相当。
3.3 QP对氧化应激、MPO水平和LDH释放的影响：E. coli感染导致血清MDA水平显著升高，SOD活性下降。QP处理显著降低了异常升高的MDA水平并恢复了SOD活性，同时显著抑制了血清MPO水平的升高和LDH活性的增加，表明QP能有效缓解感染诱导的氧化应激和细胞损伤。
3.4 QP对脏器病理形态的改善作用：HE染色结果显示，QP治疗显著减轻了感染雏鸡肝脏（肝索排列紊乱、细胞肿胀、充血和炎性细胞浸润）和肺脏（小叶结构破坏、肺泡间隙变窄、大量炎性细胞浸润）的组织病理学损伤，高剂量组效果最为明显。
3.5 QP对肠道组织病理的修复作用：HE染色显示，QP干预后，感染雏鸡十二指肠、空肠和回肠的绒毛结构逐渐恢复，黏膜完整性改善，炎性浸润减少，高剂量组和恩诺沙星阳性对照组效果显著，肠道组织形态接近对照组。
3.6 QP对脏器细胞焦亡相关基因表达的影响：qRT-PCR结果显示，E. coli感染显著上调了肝脏和肺脏中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β、ASC、IL-18和TNF-α的mRNA表达水平。QP预处理和恩诺沙星均能显著逆转这些基因的异常过表达，高剂量QP抑制作用最显著。
3.7 QP对肠道细胞焦亡通路基因表达的影响：在十二指肠、空肠和回肠中，E. coli感染同样广泛激活了细胞焦亡相关基因的表达。QP干预后，所有检测基因的表达均呈剂量依赖性被显著抑制。
3.8 QP对脏器细胞焦亡通路蛋白表达的影响：免疫印迹结果与基因水平变化一致，E. coli感染显著增加了肝脏和肺脏中NLRP3、GSDMD、Caspase-1 p20、IL-1β和ASC的蛋白表达，而QP预处理和恩诺沙星均能显著抑制这些关键蛋白的异常表达。
3.9 QP对肠道细胞焦亡通路蛋白表达的影响：在十二指肠、空肠和回肠中，免疫印迹分析显示QP干预能以剂量依赖的方式显著抑制由感染诱导的细胞焦亡相关蛋白（NLRP3、GSDMD、Caspase-1 p20、IL-1β和ASC）的异常升高。
3.10 QP对LPS诱导雏鸡肠炎的作用：在抗生素清除菌群的LPS肠炎模型中，QP处理组和抗生素清除菌群组均能改善LPS感染引起的脏器指数和体重异常，并显著修复肠道黏膜结构损伤，两组间无统计学差异。
3.11 QP对肠炎雏鸡氧化应激、MPO和LDH的影响：QP处理组和抗生素清除菌群组均能有效降低LPS感染导致的血清MDA升高、恢复SOD活性、抑制MPO和LDH的异常升高，且两组间无统计学差异，表明无论有无肠道菌群，QP均能发挥等效的治疗效果。
3.12 QP缓解雏鸡肠道炎症的机制探究：在抗生素清除菌群的LPS肠炎模型中，QP处理组和抗生素清除菌群组均能显著抑制细胞焦亡通路关键蛋白和基因的过表达，表明QP通过抑制细胞焦亡通路缓解细菌性肠炎，这种保护作用可能不依赖于肠道菌群。
四、讨论与结论
讨论部分指出，植物多酚因其多功能性和低耐药性成为理想的抗生素替代候选物。本研究的体外抗菌试验显示QP的直接杀菌活性较弱，提示其在体内的保护作用并非主要通过直接抗菌介导，而是通过其活性成分靶向宿主免疫细胞，抑制细胞焦亡通路的过度激活并减少促炎因子的释放。QP的多器官保护功能与其强大的抗炎和抗氧化效应相一致。研究进一步证实，抑制细胞焦亡是植物多酚对抗E. coli LPS诱导的多器官损伤的共同关键机制。与目前广泛应用的依赖于微生物群的策略相比，QP通过不依赖肠道菌群的方式发挥抗炎作用，这一独特优势增强了其在复杂养殖环境中的应用潜力。
研究结论：本研究证实，QP能显著缓解E. coli感染诱导的雏鸡多器官（肝、肺、肠）损伤和炎症反应。进一步的机制研究利用LPS诱导的炎症模型证实，QP对肠道细胞焦亡的抑制作用不依赖于完整的肠道共生菌群的存在，这为其体内抗炎活性提供了初步的机制见解。后续研究表明，这种效应可能主要通过抑制细胞焦亡信号通路介导，从而协同发挥其抗炎、抗氧化和多器官保护作用。总之，QP通过不依赖于肠道菌群的细胞焦亡通路调控，缓解了鸡只E. coli感染引起的全身性损伤。
