《EcoHealth》：Adapting Flow Cytometry for Studying Immune Cell Seasonality in Wild Migratory Bats
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：识别野生动物免疫力的驱动因素对于评估应激源影响和人兽共患病风险至关重要。然而，此类研究受限于野生动物研究的后勤挑战以及物种特异性试剂的缺乏。研究人员将通常局限于实验室环境的流式细胞术（flow cytometry）适配至野外环境，以利用少量血液样本和延长的样
：识别野生动物免疫力的驱动因素对于评估应激源影响和人兽共患病风险至关重要。然而，此类研究受限于野生动物研究的后勤挑战以及物种特异性试剂的缺乏。研究人员将通常局限于实验室环境的流式细胞术（flow cytometry）适配至野外环境，以利用少量血液样本和延长的样本保存时间对细胞免疫进行 profiling。随后，研究人员将这些方法初步应用于迁徙性墨西哥无尾蝠（Tadarida brasiliensis）免疫细胞季节性的评估。研究人员确认了四种识别CD3、CD79a、MHCII和CD11b的抗体，这些抗体最初在埃及果蝠（Rousettus aegyptiacus）中经过验证，从而分别实现对T细胞、B细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的定量。流式细胞术在定量白细胞谱方面优于血液学方法，并揭示了可变的免疫细胞季节性。适应性细胞在春季和秋季迁徙之间增加。中性粒细胞在繁殖期最为丰富，并在迁徙期间减少，而B细胞在繁殖后和秋季迁徙前最为丰富；粒细胞整体、巨噬细胞和T细胞则无季节性变化。雌性个体的B细胞多于雄性，但其他细胞类型无差异。研究结果为将流式细胞术应用于野生动物野外研究奠定了基础，并为蝙蝠免疫力的季节性提供了初步见解。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
理解野生动物免疫系统的动态变化对于评估环境 stressors 对宿主的影响以及预测人兽共患病的传播风险具有重要意义。免疫状态可随环境变化而改变，进而影响宿主对病原体的易感性以及病原体脱落的持续时间或强度。在资源有限的条件下，动物需要在繁殖、迁徙等耗能生命阶段与免疫功能之间进行生理权衡（trade-off）。先天免疫（innate immunity）由巨噬细胞和中性粒细胞主导，形成广泛而快速的防御，但激活和维持成本较高；适应性免疫（adaptive immunity）则通过T细胞和B细胞介导抗原特异性应答，发育投入较大但二次暴露时反应成本较低。因此，在能量需求较高的时期，宿主可能倾向于依赖先天免疫以节约资源，而在资源充裕时期则转向适应性免疫。
迁徙是潜在的高成本内在应激源，可调节免疫并改变宿主对新发或慢性感染的易感性。尽管迁徙行为在多个蝙蝠科中普遍存在，但关于迁徙对蝙蝠免疫影响的认知仍十分有限。蝙蝠作为多种人兽共患病病原体的储存宿主，其独特的免疫机制（如炎症反应减弱）使其能够耐受多种烈性感染，同时也可能使其在迁徙过程中通过免疫权衡而增加病原体传播风险。然而，研究野生蝙蝠免疫系统面临诸多障碍，包括物种特异性试剂缺乏、野外适用性检测手段不足，以及缺乏针对特定免疫细胞的精细分析工具。传统血液学方法仅能大致区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，分辨率有限。流式细胞术虽能实现免疫细胞亚群的精细表征，但受限于大血量和物种特异性试剂需求，长期局限于实验室或圈养系统。因此，将流式细胞术适配至野外蝙蝠研究，并探索迁徙性蝙蝠免疫细胞的季节性变化，具有重要的生态学和公共卫生意义。
二、研究内容与主要结论
研究人员针对上述问题开展了一项系统性研究。首先，利用实验室小鼠优化了最小可行采血量，确定30 μL血液即可产生足够的荧光信号并保持准确的细胞比例。随后，研究人员将在埃及果蝠中验证过的五种单克隆抗体在墨西哥无尾蝠中进行交叉反应性测试，确认其中四种（CD3、CD79a、CD11b、MHCII）可有效识别相应免疫细胞，而CD206不兼容。基于此抗体组合，研究人员对2023年3月至9月间采自俄克拉何马州西部两个洞穴栖息地的37只野生墨西哥无尾蝠进行了流式细胞术分析，并与传统血液涂片方法进行比较。研究发现，流式细胞术在淋巴细胞比例的定量上与血液学方法中度相关，但粒细胞比例的两种方法间无一致性，且血液学方法倾向于低估淋巴细胞比例而高估粒细胞比例。季节性分析显示，淋巴细胞比例从春季迁徙经繁殖期至秋季迁徙显著增加，粒细胞比例则呈边缘性下降趋势。在具体细胞亚群中，中性粒细胞在繁殖期最为丰富、迁徙期间最低，B细胞在繁殖后及秋季迁徙前达到峰值，而巨噬细胞和T细胞无显著季节性变化。性别差异方面，雌性个体B细胞比例显著高于雄性，其他细胞类型无性别差异。研究未检测到细胞免疫各分支间的显著权衡关系，但效应量提示粒细胞与淋巴细胞、中性粒细胞与巨噬细胞、T细胞与B细胞之间存在弱负相关趋势。
三、主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：其一，以实验室小鼠为模型进行采血量优化试验，将100 μL小鼠血液分装为50、40、30、20、10 μL不同体积，通过流式细胞术评估各体积下的荧光质量和细胞比例准确性，确定30 μL为最小可行采血量。其二，在野外条件下对野生蝙蝠进行血液采集和样本处理，采用翅静脉穿刺采集30–40 μL血液，在野外完成抗体染色和固定，样本在4°C条件下平均保存36小时后运送至实验室进行分析。其三，利用流式细胞术结合多色抗体组合（CD3、CD79a、MHCII、CD11b）对免疫细胞亚群进行鉴定和定量，通过前向散射和侧向散射参数建立设门策略，区分淋巴细胞和粒细胞群体。其四，采用广义加性模型（GAMs）分析免疫细胞比例的季节性变化趋势，以周数为循环三次样条项，同时纳入样本处理时间和采集等待时间作为精度协变量。其五，将流式细胞术结果与传统血液涂片白细胞分类计数进行比较，通过Spearman相关性评估两种方法的一致性。
四、研究结果
抗体验证与采血量优化：研究人员通过小鼠试验确定30 μL为产生足够荧光信号的最小采血量，该体积低于多数小型哺乳动物体重的1%，适用于野外蝙蝠采样。在墨西哥无尾蝠中，四种抗体（CD3、CD79a、CD11b、MHCII）获得充分荧光信号，CD206不兼容，表明部分抗体可能在翼手目内部具有跨物种保守性。
流式细胞术与血液学方法比较：淋巴细胞比例在两种方法间呈中度显著相关（ρ=0.62），但粒细胞比例无一致性（ρ=0）。流式细胞术得到的淋巴细胞比例在67%的个体中高于血液学方法，而93%的个体中血液学方法高估了粒细胞比例，表明传统血液学方法在白细胞谱定量上存在系统性偏差。
免疫细胞季节性变化：广义加性模型分析显示，淋巴细胞比例从春季迁徙经繁殖期至秋季迁徙显著增加，粒细胞比例呈边缘性下降趋势。中性粒细胞在繁殖期达到峰值并在迁徙期间降低，B细胞在繁殖后及秋季迁徙前最为丰富，巨噬细胞和T细胞无显著季节性变化。样本等待时间对所有细胞类型均无显著影响，处理时间仅对巨噬细胞比例有显著影响。
性别差异分析：在控制季节性因素后，雌性个体的B细胞比例显著高于雄性，其他免疫细胞类型无显著性别差异。但该分析中等待时间和处理时间均为B细胞比例的显著预测因子，提示可能存在采样伪影影响。
免疫权衡检测：个体水平的相关性分析未发现细胞免疫各分支间存在显著权衡关系，但效应量显示粒细胞与淋巴细胞（ρ=-0.08）、中性粒细胞与巨噬细胞（ρ=-0.17）、T细胞与B细胞（ρ=-0.22）之间存在弱负相关趋势，提示可能存在尚未达到统计显著水平的免疫权衡。
五、讨论与结论
本研究的核心意义在于将流式细胞术从实验室拓展至野外蝙蝠研究场景，为野生动物细胞免疫的精细表征提供了可行方案。研究确认了跨深分支蝙蝠谱系（Rousettus与Tadarida属分化约5000–6000万年）的抗体交叉反应性，表明部分免疫标记物可能基于高度保守的机制，有望在更广泛的蝙蝠类群中应用。流式细胞术相较于传统血液学方法能够更精确地定量白细胞组成，尤其有助于识别稀有细胞类型和区分宽泛细胞类别中的亚群，为跨物种免疫比较研究提供了标准化工具。
研究结果初步支持了研究人员的假设，即在迁徙和繁殖等能量消耗较大的时期，蝙蝠倾向于投资先天免疫细胞。淋巴细胞比例在春季迁徙后和繁殖期最低，在非繁殖期和秋季迁徙前增加，而粒细胞呈相反趋势，这可能反映了春季迁徙与早孕耦合带来的更高能量成本。B细胞在繁殖后和秋季迁徙前的升高可能对理解蝙蝠病毒感染的季节性具有重要意义。然而，研究受限于样本量较小以及繁殖高峰期和哺乳期、秋季迁徙期间采样的缺失，季节性模式的稳健性有待进一步验证。未来研究需要在更精细的时间尺度上进行多年重复采样，并在越冬地补充采样，以更全面地评估蝙蝠能量状态与细胞免疫各分支间的权衡关系。此外，30 μL采血量的优化使得体重超过6克的蝙蝠物种均可进行流式细胞术分析，但更小体型物种（约占蝙蝠多样性的15%）仍面临采血量限制，需要进一步开发微量样本分析技术。
