WTAP通过m6A相关转录后调控TRAF6影响实验性细胞模型中血管可塑性相关表型的机制研究

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：WTAP regulates TRAF6 expression and vascular plasticity-associated phenotypes in experimental cell models

　　

背景：肝细胞癌（HCC）是一种高度血管化的恶性肿瘤，以显著的肿瘤血管可塑性为特征。血管生成拟态（VM）相关表型与肿瘤侵袭性行为及抗血管生成治疗敏感性降低有关，但HCC中促成这些表型的表观转录组学机制仍不完全明确。本研究在实验模型中检验了Wilms瘤1相关蛋白（WTAP）是否通过m⁶A相关的TNF受体相关因子6（TRAF6）转录后调控来调节细胞生长和血管可塑性相关表型。方法：采用RT-qPCR和Western blotting检测HepG2和BEL-7402细胞及肝细胞对照中WTAP和TRAF6的表达。进行功能获得和功能缺失实验，评估细胞活力、伤口闭合、侵袭、所检测细胞在肿瘤细胞-HUVEC共培养中支持血管样网络形成的能力，以及血管可塑性和EMT相关蛋白的表达。采用MeRIP-qPCR评估TRAF6转录本的m⁶A富集，并进行放线菌素D追踪实验评估TRAF6 mRNA稳定性。采用WT/MUT报告基因实验、YTHDF1 RNA免疫沉淀后qPCR（RIP-qPCR）和YTHDF1耗竭实验检查TRAF6调控的其他方面。采用皮下异种移植模型评估肿瘤生长和PAS阳性/CD31阴性VM样结构。结果：所检测细胞中WTAP和TRAF6表达上调。WTAP过表达增强细胞活力、伤口闭合、侵袭、肿瘤细胞支持的血管样网络形成以及血管可塑性/EMT相关分子变化。WTAP干预改变TRAF6 mRNA丰度、m⁶A富集和降解；其对WT报告基因的作用大于MUT报告基因。WTAP过表达还增加YTHDF1免疫沉淀物中TRAF6 RNA的回收量。YTHDF1耗竭降低了相关的TRAF6蛋白增加，尽管mRNA持续升高。TRAF6敲低减弱WTAP驱动的表型和肿瘤生长，而TRAF6过表达部分挽救WTAP敲低的效果。PAS/CD31染色为VM样形态提供定性证据。结论：WTAP部分通过伴随m⁶A富集和mRNA稳定性改变的TRAF6转录后调控，参与所观察到的细胞和异种移植表型。YTHDF1可能调节TRAF6蛋白，但其在mRNA稳定化中的作用尚未证实。确切的m⁶A位点和VM样结构的灌注情况仍不清楚，需要在临床相关的HCC模型和人类标本中验证。

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，具有复发频繁、转移进展及晚期患者长期生存有限的特点。尽管分子靶向治疗、免疫检查点阻断及联合治疗取得进展，原发性和获得性耐药仍是主要临床挑战。HCC也是高度血管化的恶性肿瘤，血管生成信号和肿瘤血管的动态重塑支持肿瘤生长、播散、代谢适应和治疗耐药。血管生成拟态（VM）指高侵袭性肿瘤细胞在无常规内皮衬覆的情况下组织成富含细胞外基质的血管通道样网络的能力，反映恶性细胞的表型可塑性及其与细胞外基质的相互作用。组织学上，PAS阳性/CD31阴性的通道样结构常被用作识别VM样结构的操作性标准，但仅凭形态不能证实其具有功能灌注或与宿主循环相连。VM相关表型与血管生成、细胞外基质重塑、上皮-间质转化（EMT）、干样可塑性及缺氧适应广泛重叠，VE-cadherin、基质金属蛋白酶、VEGFA、血管生成素-2及EMT相关蛋白常在VM相关重塑中改变，但这些分子并非VM特异。TNF受体相关因子6（TRAF6）是一种信号衔接蛋白和E3泛素连接酶，整合Toll样受体、白介素-1受体、TNF受体超家族成员及其他炎症通路信号。TRAF6依赖的K63连接泛素化促进NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶及相关信号网络激活，调控细胞存活、炎症、免疫应答、侵袭和组织重塑。HCC中TRAF6表达升高与肿瘤进展和不良临床结局相关，实验性抑制TRAF6可减少HCC细胞生长和侵袭行为。N6-甲基腺苷（m⁶A）是真核mRNA普遍存在的内部修饰，影响转录本加工、核输出、稳定性、翻译和降解。METTL3和METTL14构成经典m⁶A甲基转移酶复合物的核心异二聚体，WTAP作为必需调节亚基促进该复合物的核定位和向RNA底物的募集，但其本身并非主要催化酶。因此，干预WTAP评估的是m⁶A机器调节组分的贡献，并不能确立所观察效应独立于METTL3、METTL14或其他m⁶A调节因子。选择WTAP是因为既往研究提示其参与HCC进展：WTAP在HCC组织中升高，可通过m⁶A相关调控HuR-ETS1-p21/p27通路促进肿瘤细胞增殖和细胞周期进展；临床和生物信息学分析将WTAP高表达与不良预后、肿瘤增殖及免疫细胞浸润改变相关联；m⁶A失调还可通过调节Hippo通路活性与HCC的VM形成相关。TRAF6也受m⁶A机器的转录后调控：在肠上皮细胞中，m⁶A阅读蛋白YTHDF1可识别m⁶A修饰的TRAF6转录本并在先天免疫激活时增强其翻译。但肠道免疫背景的证据不能确立YTHDF1或相同阅读蛋白依赖机制在HCC中起作用；WTAP在HCC中是否影响TRAF6转录本丰度、稳定性或翻译以及哪些m⁶A阅读蛋白参与仍待阐明。近期有报道在多囊卵巢综合征模型中存在WTAP介导的TRAF6 m⁶A调控，因此WTAP-TRAF6关系本身并非HCC独有，本研究的增量问题在于WTAP相关TRAF6调控是否参与肝肿瘤模型的血管可塑性相关表型。本研究检测HepG2和BEL-7402细胞中WTAP和TRAF6表达，进行功能获得和缺失分析，评估细胞活力、伤口闭合、侵袭、血管样网络形成及血管可塑性/EMT相关分子变化；用MeRIP-qPCR和放线菌素D追踪实验评估TRAF6 m⁶A富集和mRNA稳定性；用WT/MUT报告基因、YTHDF1 RIP-qPCR和YTHDF1耗竭检查报告基因反应性、RNA结合及转录本和蛋白水平表达；进行挽救实验确定TRAF6是否功能性参与WTAP相关表型；用肿瘤细胞-HUVEC共培养评估细胞支持血管样网络形成的能力，用PAS/CD31染色识别异种移植瘤中的VM样组织学结构。由于共培养系统不能区分肿瘤细胞自主性VM与内皮辅助的网络形成，且未在体内检查功能灌注，所得血管表型被解释为VM相关和促血管生成改变，而非功能性VM通道的确切证据。

材料与方法：从Genomic Data Commons/Xena获取TCGA肝细胞癌队列（TCGA-LIHC）的RNA测序表达谱和临床注释，纳入原发肿瘤和实体组织正常样本，表达值按log2（TPM+1）处理。比较原发肿瘤与正常肝组织中WTAP和TRAF6表达，用Spearman相关分析评估原发肿瘤样本中的共表达关系；以WTAP和TRAF6 z标准化表达值的均值计算每个原发肿瘤样本的WTAP-TRAF6轴评分。从Molecular Signatures Database获取Hallmark血管生成、缺氧、EMT和TNFα经NF-κB信号基因集，用单样本基因集富集分析（ssGSEA）在单样本水平估计基因集活性；用CDH5、EPHA2、LAMC2、MMP2、MMP9、VEGFA、ANGPT2、HIF1A和VIM计算VM相关转录特征，该评分被解释为VM相关转录特征而非组织学或功能性VM形成的直接证据。从TCGA临床注释提取组织学分级和病理分期，总生存期定义为从诊断到死亡或末次随访的间隔；Kaplan-Meier分析按WTAP表达中位数分为高、低表达组。所有统计检验为双侧；肿瘤-正常比较用Wilcoxon秩和检验，配对肿瘤-正常分析用Wilcoxon符号秩检验，临床病理组间比较用Kruskal-Wallis检验继以Benjamini-Hochberg校正的Dunn检验，生存差异酌情用log-rank检验和Cox比例风险模型。细胞培养：HepG2、BEL-7402、Huh7、供应商指定的非恶性人肝细胞对照及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自指定供应商，按相应培养基培养并补充10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，均在37 °C、5% CO₂湿润培养箱中维持。HepG2为肝母细胞瘤来源细胞系；BEL-7402在Cellosaurus中被列为污染性HeLa来源细胞系，因此本研究不将其视为经认证的成人HCC模型。RNA提取和RT-qPCR：用细胞/组织总RNA分离试剂盒提取总RNA，NanoDrop分光光度计评估浓度和纯度，用HiScript III第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix在Bio-Rad CFX96 Touch实时PCR系统上进行RT-qPCR，以GAPDH为参照基因用2^?ΔΔCt法计算相对转录本水平。细胞转导和稳定细胞系建立：用携带靶向人WTAP（sh-WTAP）或TRAF6（sh-TRAF6）短发夹RNA的慢病毒载体及相应的非靶向对照载体（sh-NC）建立稳定敲低细胞系；用表达全长人WTAP（oe-WTAP）或TRAF6（oe-TRAF6）的慢病毒载体及相应空载体对照（oe-NC）建立稳定过表达细胞系。细胞培养至约60%–70%汇合后按慢病毒悬液与培养基1:100（v/v）比例转导，不使用polybrene或其他转导增强试剂；24 h后更换新鲜完全培养基，转导后48 h用5 μg/mL嘌呤霉素筛选至相应未转导对照细胞完全死亡，存活的嘌呤霉素抗性细胞扩增为稳定多克隆细胞群。初步评估候选shRNA构建体，选择使相应靶标表达降低最多的构建体用于后续细胞和异种移植实验；并在HepG2、BEL-7402和Huh7细胞的五个联合干预组中检测WTAP和TRAF6蛋白水平以记录挽救构建体的分子效应。YTHDF1耗竭：用RT-qPCR评估三种靶向YTHDF1的siRNA（si-YTHDF1 #1、#2和#3）相对于非靶向siRNA对照（si-NC）的效果；随后在oe-NC + si-NC、oe-WTAP + si-NC和oe-WTAP + si-YTHDF1组中检测TRAF6 mRNA及TRAF6和YTHDF1蛋白表达。Western blotting：用含苯甲基磺酰氟的冰RIPA裂解缓冲液提取培养细胞或异种移植瘤组织总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，等量蛋白经5%–12% SDS-PAGE分离并转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后与指定一抗4 °C孵育过夜，Tris缓冲盐水含0.1% Tween-20洗涤三次后与相应辣根过氧化物酶偶联二抗室温孵育1 h，增强化学发光系统显影并用JP-K600成像系统采集，ImageJ软件（Fiji，NIH）定量条带强度并以GAPDH或β-actin归一化。所用一抗包括兔单克隆抗WTAP（克隆EPR18744，ab195380）、抗TRAF6（克隆EP592Y，ab40675）、抗血管生成素-2（克隆EPR2891 (2)，ab155106）、兔多克隆抗VEGFA（ab46154）、兔单克隆抗MMP2（克隆EPR1184，ab92536）、抗N-cadherin（克隆EPR1791-4，ab76011）和小鼠单克隆抗E-cadherin（克隆4A2，ab231303），均购自Abcam；兔多克隆抗VE-cadherin（#2158）、兔单克隆抗MMP9（克隆D6O3H，#13667）、抗vimentin（克隆D21H3，#5741）和抗β-actin（克隆13E5，#4970）购自Cell Signaling Technology，稀释度1:1,000；兔单克隆抗GAPDH（克隆14C10，#2118；Cell Signaling Technology）稀释度1:10,000。辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔IgG（ab6721，Abcam）和山羊抗小鼠IgG（ab6789，Abcam）作为二抗，稀释度1:20,000。放线菌素D追踪实验：为评估TRAF6 mRNA稳定性，对携带稳定WTAP敲低、WTAP过表达或相应对照载体的HepG2和BEL-7402细胞以5 μg/mL终浓度放线菌素D处理以抑制从头转录，处理后0、3、6和9 h收集细胞，提取总RNA行RT-qPCR分析TRAF6 mRNA表达，以GAPDH归一化，各时间点剩余TRAF6 mRNA水平相对于0 h值（设为1）表示；每实验独立进行三次。CCK-8实验：用CCK-8试剂盒评估细胞活力，每孔2 × 10³个细胞接种于96孔板，复孔六个，37 °C、5% CO₂孵育6 h，在CO₂培养箱中孵育指定时间后用酶标仪检测450 nm吸光度。伤口愈合实验：划痕并洗去脱落细胞后，在24 h伤口愈合期间用无血清培养基培养以减少增殖对伤口闭合的潜在贡献；六孔板中培养细胞至汇合（1 × 10⁶ cells/mL），用1 mL移液器吸头在每孔细胞单层上划直线划痕，于0和24 h采集划痕线与网格标记相交区域的图像，用ImageJ软件测量区域并计算相对伤口闭合率（%）。Transwell实验：将指定处理组细胞重悬于无血清培养基，以2 × 10⁵ cells/mL密度接种于Matrigel包被的Transwell小室上室，下室填充600 μL含10% FBS的完全培养基作为趋化剂；37 °C孵育24 h后用棉签轻拭去膜上表面未侵袭细胞，侵袭通过Matrigel包被膜的细胞用4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，ZEISS显微镜拍摄代表性视野并用ImageJ软件定量侵袭细胞数；每实验独立进行三次。肿瘤细胞-HUVEC血管样网络形成实验：将HUVEC与携带指定稳定WTAP或TRAF6修饰的HepG2或Huh7细胞共培养以评估所检细胞支持血管样网络形成的能力；Matrigel于4 °C过夜解冻，分装至预冷96孔板并37 °C聚合30 min，HUVEC与所检细胞按1:1混合并以2 × 10⁵ cells/mL总密度重悬，混合细胞悬液接种于Matrigel包被孔中37 °C孵育16 h，倒置显微镜拍摄血管样网络，用ImageJ的Angiogenesis Analyzer插件定量节点数、连接点数和网孔数及总网络长度；每实验独立进行三次。甲基化RNA免疫沉淀：RNA在m⁶A MeRIP试剂盒的片段化缓冲液中70 °C片段化5 min，冷却并纯化；抗m⁶A抗体与磁珠室温孵育1 h，片段化RNA与抗体-磁珠复合物4 °C轻摇孵育约1 h，洗涤去除非特异性结合RNA后洗脱并结合RNA纯化用于RT-qPCR分析，保留Input RNA作为对照。MeRIP-qPCR实验被解释为指定条件下TRAF6 m⁶A相对富集的转录本水平测量，不用于推断WTAP与TRAF6 RNA的直接物理结合或将甲基化定位到单个腺苷。WT/MUT双荧光素酶报告基因实验：比较WT + oe-NC、WT + oe-WTAP、MUT + oe-NC和MUT + oe-WTAP报告基因条件下的相对荧光素酶读数，以评估WTAP相关反应在WT和MUT构建体之间是否存在差异。YTHDF1 RNA免疫沉淀：在oe-NC和oe-WTAP组用抗YTHDF1抗体或IgG对照进行RNA免疫沉淀，通过RT-qPCR评估免疫沉淀组分中回收的TRAF6 RNA以评估其与YTHDF1的结合。异种移植瘤模型：6–8周龄雄性裸鼠购自江西中洪博元生物科技有限公司（动物许可证号SYXK-2020–0001），在无特定病原体条件下饲养。Figure 1所示五组异种移植实验将小鼠随机分为sh-NC + oe-NC、oe-WTAP + sh-NC、oe-WTAP + sh-TRAF6、sh-WTAP + oe-NC和sh-WTAP + oe-TRAF6组，每组六只（n = 6/组）；Figure 2所示异种移植组织Western blot分析使用这五组的肿瘤组织，队列大小和用于蛋白定量的肿瘤数在图注中区分。Figure 3另进行三组异种移植实验，包括sh-NC + oe-NC、oe-WTAP + sh-NC和oe-WTAP + sh-TRAF6组，每组三只（n = 3/组）。接种时以60 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，碘伏消毒左侧胁腹，将指定转染的HepG2细胞皮下注射至小鼠左侧胁腹，每5天测量肿瘤体积；实验终点时通过以每分钟50%腔室容积的置换速率逐渐暴露于100% CO₂安乐死小鼠，在收集肿瘤组织前通过无自主呼吸和心跳确认死亡。所有动物实验经广东医科大学附属东莞第一医院实验动物伦理委员会批准，按机构指南和ARRIVE指南进行。两次异种移植实验均使用雄性小鼠，未评估性别依赖效应；五组和三组实验作为独立队列报告，不合并。PAS染色和CD31免疫组化：异种移植瘤组织用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋并切片；进行PAS染色以显示富含基质的通道样结构，在连续肿瘤切片上进行CD31免疫组化以区分内皮细胞衬覆血管与VM样结构，PAS阳性/CD31阴性通道样结构定义为VM样结构；光镜下拍摄代表性图像用于VM样形态的定性评估，Figure 3E未提供VM样结构的定量计数。PAS和CD31在连续切片而非同一切片双重染色上评估；所展示的组织学评估为定性，未进行盲法定量VM样结构计数或直接血管灌注分析，因此该染色被解释为支持VM样形态而非功能性VM的确切证据。统计分析：用GraphPad Prism 8.0版进行统计分析，数据以均值±标准差（SD）表示，独立生物学重复或动物数在相应图注中说明，技术重复不作为独立观察。统计检验前评估数据分布：两组比较对正态分布数据用双尾非配对Student t检验，对非正态分布数据用Wilcoxon秩和检验；多组比较用单因素方差分析继以Tukey多重比较检验；肿瘤生长曲线用双因素重复测量方差分析及适当事后多重比较检验。所有统计检验为双侧，P < 0.05认为有统计学意义。由于PAS/CD31评估为定性且未生成VM样结构计数，该组织学终点未应用推断性统计检验。

结果：一、所检细胞系中WTAP和TRAF6表达升高。为检查所检细胞中WTAP和TRAF6的表达模式，比较非恶性人肝细胞与所检细胞系HepG2和BEL-7402中的mRNA和蛋白水平。RT-qPCR分析显示HepG2和BEL-7402细胞中WTAP和TRAF6 mRNA水平显著高于非恶性肝细胞；Western blotting一致显示两种细胞系中WTAP和TRAF6蛋白表达增加。这些发现表明在所检细胞模型中WTAP和TRAF6同时上调。为评估WTAP的功能贡献，用CCK-8实验分析稳定敲低或过表达WTAP的HepG2和BEL-7402细胞，WTAP敲低显著降低细胞活力，而WTAP过表达相对于sh-NC组增加细胞活力；这些结果支持WTAP在维持所检细胞活力中的正向作用。二、WTAP表达促进所检细胞中VM相关分子变化。为确定WTAP是否影响与血管可塑性和EMT相关的分子程序，检测稳定敲低或过表达WTAP的HepG2和BEL-7402细胞中血管生成、VM和EMT相关蛋白的表达。HepG2细胞中，WTAP敲低降低Ang2和VEGFA蛋白水平，而WTAP过表达相对于相应对照组增加其表达；VE-cadherin、MMP2和MMP9呈相似变化，WTAP敲低后表达降低、过表达后升高。WTAP敲低还降低N-cadherin和vimentin表达同时增加E-cadherin表达；相反，WTAP过表达增加N-cadherin和vimentin水平并降低E-cadherin表达。BEL-7402细胞中观察到可比表达模式：WTAP敲低降低Ang2、VEGFA、VE-cadherin、MMP2、MMP9、N-cadherin和vimentin表达并增加E-cadherin表达，而WTAP过表达产生相反效应。总之，这些结果表明WTAP使所检细胞转向与血管可塑性、细胞外基质重塑、促血管生成信号和EMT相关的蛋白表达谱；由于这些蛋白并非VM特异标志物，该发现被解释为VM相关和促血管生成分子改变的证据，而非VM形成的直接证据。三、WTAP增强肿瘤细胞支持的血管样网络形成及相关分子变化。为评估WTAP是否影响血管网络相关表型，将携带WTAP或TRAF6修饰的HepG2和Huh7细胞与HUVEC在Matrigel上共培养。与oe-NC + sh-NC相比，WTAP过表达在两种共培养模型中均增加连接点数和总段长度；这些读数在oe-WTAP + sh-TRAF6组低于oe-WTAP + sh-NC组。sh-WTAP + oe-TRAF6组也显示相对于对照网络形成减少；由于这些图板未包含sh-WTAP + oe-NC组，该实验不能独立确立TRAF6过表达对网络表型的挽救。Western blotting显示WTAP过表达增加VE-cadherin和MMP9表达同时降低E-cadherin表达，TRAF6敲低减弱WTAP过表达细胞中的这些变化；sh-WTAP + oe-TRAF6组VE-cadherin和MMP9低于对照、E-cadherin高于对照。额外Western blot记录了HepG2和Huh7细胞全部五个构建体验证组中WTAP和TRAF6蛋白表达：WTAP过表达细胞经sh-TRAF6处理后TRAF6蛋白降低，WTAP敲低细胞经oe-TRAF6处理后TRAF6蛋白升高，同时相应WTAP干预仍明显。这些验证实验支持对联合干预的解释，但不提供缺失的网络形成比较；由于网络实验使用肿瘤细胞-HUVEC共培养，其不能确立肿瘤细胞自主性VM形成。四、WTAP相关TRAF6 RNA调控伴随WT/MUT报告基因反应和YTHDF1依赖的蛋白调控。为确定WTAP是否在转录后水平调控TRAF6，检测携带sh-NC + oe-NC、oe-WTAP + sh-NC或sh-WTAP + oe-NC的HepG2和BEL-7402细胞中TRAF6 mRNA表达。RT-qPCR分析显示WTAP敲低显著降低TRAF6 mRNA水平，而WTAP过表达相对于相应对照组增加TRAF6 mRNA表达。随后进行MeRIP-qPCR评估TRAF6转录本的m⁶A富集：WTAP过表达增加抗m⁶A免疫沉淀组分中TRAF6 RNA的回收，而WTAP敲低在两种细胞系中均降低TRAF6 m⁶A富集；这些数据表明WTAP表达与TRAF6转录本的m⁶A富集正相关。为进一步评估WTAP是否影响TRAF6 mRNA稳定性，进行放线菌素D追踪实验：转录抑制后WTAP过表达延缓TRAF6 mRNA降解，而WTAP敲低在HepG2和BEL-7402细胞中加速TRAF6 mRNA降解。总之，这些发现支持WTAP依赖的TRAF6 m⁶A富集变化与TRAF6 mRNA稳定性维持之间的关联；这些实验未鉴定单个甲基化腺苷或确立哪种阅读蛋白介导mRNA稳定性变化。为扩展机制分析，在对照和WTAP过表达条件下比较WT和MUT报告基因构建体：WTAP过表达增加WT报告基因读数，而MUT报告基因反应较小；MUT仍可检测到残余增加，表明报告基因反应性是减弱而非完全丧失。首先在mRNA水平评估YTHDF1敲低：所测三种siRNA中si-YTHDF1 #2显示最低的剩余YTHDF1 mRNA信号。RIP-qPCR在oe-NC和oe-WTAP组中均检测到抗YTHDF1较IgG更高的TRAF6 RNA回收，且WTAP过表达后YTHDF1组分中回收更高；这些结果支持YTHDF1与TRAF6 RNA之间的结合。TRAF6 mRNA在oe-WTAP + si-YTHDF1组中仍保持升高，该图板未标注两个WTAP过表达组之间的统计学比较，因此不能推断其mRNA水平等效。相反，Western blotting显示YTHDF1耗竭相对于oe-WTAP + si-NC降低TRAF6蛋白并证实YTHDF1蛋白降低。总之，这些观察提示YTHDF1参与WTAP相关TRAF6蛋白调控，但未确立YTHDF1介导TRAF6 mRNA稳定化。五、TRAF6参与WTAP介导的细胞活力、伤口闭合和侵袭。为确定TRAF6是否参与WTAP的细胞效应，在稳定敲低或过表达WTAP和/或TRAF6的HepG2和BEL-7402细胞中进行挽救实验；联合干预的蛋白水平验证见HepG2和BEL-7402相应图板。在两种细胞系中，TRAF6过表达在WTAP敲低情况下仍增加TRAF6蛋白，而TRAF6敲低在WTAP过表达情况下仍降低其表达。CCK-8实验显示WTAP过表达相对于sh-NC + oe-NC对照组增加细胞活力，TRAF6敲低在oe-WTAP + sh-TRAF6组较oe-WTAP + sh-NC组显著减弱该增加；相反，TRAF6过表达部分恢复WTAP敲低引起的细胞活力降低，尽管sh-WTAP + oe-TRAF6组活力仍低于对照组。伤口愈合实验显示相似模式：WTAP过表达增加24 h伤口闭合，而TRAF6敲低减弱WTAP过表达的效应；TRAF6过表达部分恢复WTAP敲低细胞的伤口闭合，但挽救未使伤口闭合回到对照水平。Transwell侵袭实验进一步显示WTAP过表达增加两种细胞系中侵袭细胞数，该效应在oe-WTAP + sh-TRAF6组被TRAF6敲低减弱；相反，TRAF6过表达部分挽救WTAP敲低引起的侵袭降低，尽管sh-WTAP + oe-TRAF6组侵袭能力仍低于对照组。总之，这些结果表明TRAF6参与WTAP介导的细胞活力、伤口闭合和侵袭调控；TRAF6过表达后观察到的部分挽救提示其他WTAP调控因子也可能参与这些细胞表型。六、TRAF6参与WTAP介导的异种移植瘤生长，并伴VM样组织学观察。为评估WTAP和TRAF6在体内对肿瘤生长的贡献，将携带sh-NC + oe-NC、oe-WTAP + sh-NC、oe-WTAP + sh-TRAF6、sh-WTAP + oe-NC或sh-WTAP + oe-TRAF6稳定修饰的HepG2细胞皮下接种裸鼠，每5天测量肿瘤体积。与对照组相比WTAP敲低减少异种移植瘤生长，而TRAF6过表达部分恢复WTAP敲低肿瘤的肿瘤生长，但sh-WTAP + oe-TRAF6组肿瘤体积仍低于对照组；相反，WTAP过表达增加肿瘤生长，该效应被TRAF6敲低减弱但未完全消除。整个实验监测小鼠体重。在用于异种移植表达分析的三组中，sh-WTAP + oe-NC肿瘤中TRAF6 mRNA和蛋白水平低于对照肿瘤，oe-WTAP + sh-NC肿瘤中高于对照肿瘤；这些图板支持体内WTAP相关TRAF6表达调控，但未显示两个TRAF6挽救组的表达测量。另进行一项异种移植实验以进一步检查TRAF6敲低是否减弱WTAP过表达的效应：将携带sh-NC + oe-NC、oe-WTAP + sh-NC或oe-WTAP + sh-TRAF6的HepG2细胞接种裸鼠，荷瘤小鼠和切除肿瘤的代表性图像显示oe-WTAP + sh-NC组肿瘤负荷增加，而TRAF6敲低减弱该效应；一致地，肿瘤重量和纵向肿瘤生长测量显示TRAF6敲低减弱WTAP过表达诱导的异种移植瘤生长。用PAS染色和CD31免疫组化检查异种移植组织的血管相关组织学，代表性图像用于评估PAS阳性和CD31阴性通道样形态，操作性描述为VM样结构；所展示图板提供定性组织学证据，不包括VM样结构丰度的定量比较；由于未直接评估血管灌注，这些图像不能确立功能性VM通道。异种移植组织Western blotting进一步显示WTAP敲低降低Ang2和VEGFA表达，而TRAF6过表达部分恢复其表达；相反，WTAP过表达增加Ang2和VEGFA水平，该增加被TRAF6敲低减弱。VE-cadherin、MMP2和MMP9呈相似表达模式。WTAP敲低还降低N-cadherin和vimentin表达并增加E-cadherin表达，而TRAF6过表达部分逆转这些变化；相反，WTAP过表达增加N-cadherin和vimentin表达并降低E-cadherin表达，TRAF6敲低减弱这些效应。总之，体内发现支持TRAF6参与WTAP介导的异种移植瘤生长及血管可塑性和EMT相关蛋白表达，并伴定性PAS/CD31组织学观察；TRAF6干预后肿瘤生长的不完全挽救提示其他WTAP调控因子可能参与这些过程。七、TCGA-LIHC分析支持WTAP和TRAF6在人HCC中的生物学相关性。为评估WTAP和TRAF6在人HCC中的生物学相关性，分析TCGA-LIHC队列的RNA测序和临床数据。WTAP和TRAF6表达在371例原发HCC组织中显著高于50例实体正常肝组织；在原发肿瘤样本中，WTAP表达与TRAF6表达正相关。随后构建WTAP-TRAF6轴评分以评估其协同表达与血管可塑性相关转录程序的关系：经Benjamini-Hochberg校正后，较高轴评分与VM相关转录特征及血管生成、缺氧、EMT和TNFα/NF-κB通路评分正相关。WTAP表达与组织学分级呈适度但统计学显著的关联。以WTAP表达中位数为预设截断值的Kaplan-Meier分析显示，WTAP高表达患者总生存期短于WTAP低表达患者。总之，这些发现提供人HCC转录组和临床关联证据支持WTAP和TRAF6的生物学相关性，但未确立直接m⁶A调控、功能性VM形成或独立预后价值。

讨论：本研究确定TRAF6是所检模型中WTAP相关恶性和血管可塑性相关表型的功能性参与者。稳定WTAP敲低降低细胞活力、伤口闭合、侵袭及与血管生成信号、细胞外基质重塑和EMT相关蛋白的表达，而WTAP过表达产生相反效应。WTAP干预还改变TRAF6转录本丰度、m⁶A富集和mRNA降解动力学。挽救实验显示TRAF6敲低减弱WTAP过表达的效应，而TRAF6过表达部分恢复WTAP敲低所抑制的表型。YTHDF1 RIP和耗竭实验进一步将YTHDF1与TRAF6 RNA结合和蛋白调控联系起来。肿瘤生长发现得到异种移植实验支持，并伴定性PAS/CD31组织学。这些发现支持所检实验模型中WTAP-TRAF6调控关系，但TRAF6不大可能是WTAP唯一的下游介质。此处观察到的WTAP促瘤效应与既往HCC研究一致：WTAP通过m⁶A和HuR依赖的ETS1调控促进HCC生长和侵袭，WTAP高表达与不良预后和侵袭性肿瘤特征相关；然而近期显示肝细胞特异性Wtap缺失通过抑制蛋白酶体相关基因和激活GRB2-ERK信号促进肝癌发生，这一表面差异可能反映WTAP在肿瘤起始阶段非恶性肝细胞中和在已建立HCC细胞肿瘤进展中的不同功能。因此本研究结果支持WTAP在所检细胞模型中的促瘤作用，而非在肝致癌全过程中发挥统一功能。放线菌素D追踪实验显示WTAP过表达延缓TRAF6 mRNA降解而WTAP敲低加速之；结合MeRIP-qPCR，这些数据支持WTAP表达、TRAF6 m⁶A富集和转录本持续性之间的关联。额外报告基因实验显示WT构建体的WTAP相关增加大于MUT构建体，尽管MUT仍可检测到较小增加，因此突变减弱而非消除报告基因反应性。YTHDF1已被证明在肠上皮免疫信号中识别m⁶A修饰的TRAF6转录本并增强其翻译；本研究中TRAF6 RNA相对于IgG在YTHDF1免疫沉淀物中富集，且WTAP过表达时RNA回收更高；YTHDF1耗竭还降低WTAP过表达细胞中TRAF6蛋白，而TRAF6 mRNA仍保持升高。这些观察提示YTHDF1参与TRAF6蛋白调控，并符合其在转录后步骤的贡献，但未直接测量翻译效率、未排除蛋白周转改变，也未确立YTHDF1介导WTAP相关的TRAF6 mRNA稳定性变化；此外，RIP中TRAF6回收增加可能部分反映转录本丰度增加，除非证明Input归一化的占有率。因此证据支持YTHDF1参与，但未确立完全解析的位点特异性m⁶A机制。本研究的新颖性也应结合既往疾病背景理解：WTAP介导的TRAF6 m⁶A调控近期在多囊卵巢综合征中被报道，而YTHDF1依赖的TRAF6调控此前在肠上皮免疫信号中被描述；因此本研究并未声称发现WTAP-TRAF6关系本身，而是检验该调控关系是否与所检肝肿瘤模型中的血管可塑性相关表型有关。此外未进行WTAP RIP/CLIP实验，因此当前数据未确立WTAP与TRAF6 RNA的直接物理结合。当前阅读蛋白数据同样非排他性：YTHDF1被支持为参与TRAF6蛋白调控的候选者，但YTHDF2、YTHDF3、IGF2BP家族阅读蛋白和其他m⁶A结合蛋白未被系统评估，不能排除。挽救实验为TRAF6参与提供功能支持：TRAF6敲低减弱WTAP过表达诱导的细胞活力、伤口闭合、侵袭、共培养网络形成和异种移植瘤生长增加，而TRAF6过表达部分逆转WTAP敲低对细胞活力、伤口闭合、侵袭和异种移植瘤生长的影响；共培养网络实验未包含评估该挽救所需的仅WTAP敲低比较组。新增构建体验证blot通过记录相应组中WTAP和TRAF6蛋白水平加强了对细胞挽救实验的解释，这与近期SPOP介导的TRAF6泛素化和降解抑制HCC生长和转移的证据一致。多项实验中观察到的部分挽救提示TRAF6是更广泛WTAP调控RNA网络中的一个相关效应因子，而非WTAP活性的唯一介质。由于挽救是部分的，本设计不能排除其他WTAP反应性转录本或通路的间接贡献，包括既往描述的HCC和其他肿瘤背景中的WTAP靶标；因此数据支持TRAF6是WTAP相关表型的功能性参与者，而非唯一的下游介质。血管发现应在肿瘤细胞可塑性背景下解释：m⁶A依赖的YAP1调控此前已通过Hippo通路与HCC的VM形成相关；更近期研究提示Twist1依赖的VE-cadherin表达、Nrf2-ASPM轴和MAPK/ERK信号参与HCC VM相关表型。这些观察表明VM源于缺氧适应、EMT、干样可塑性、细胞外基质重塑和内皮样分化的汇聚；此处观察到的Ang2、VEGFA、VE-cadherin、MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin和vimentin协同变化与这一更广泛表型一致，但这些蛋白均非VM特异。m⁶A依赖的VM调控在不同肿瘤类型间也具背景依赖性，例如METTL3依赖的HOTAIRM1 m⁶A修饰被报道促进胶质瘤VM；结合HCC中报道的METTL3-YAP1/Hippo机制，这些观察表明不同writer、RNA靶标、阅读蛋白和下游通路可能汇聚于VM相关表型。本研究不同之处在于聚焦WTAP相关TRAF6调控，但未确立普遍或完全解析的m⁶A-VM通路。肿瘤细胞-HUVEC共培养实验也限制了对网络形成的解释：由于所检细胞与内皮细胞在Matrigel上混合，所得结构可能反映内皮组织、肿瘤-内皮协作或两者兼有；因此该实验显示WTAP修饰的肿瘤细胞在HUVEC存在时影响血管样网络形成，但未证明肿瘤细胞自主性VM。同样，PAS阳性/CD31阴性通道样结构与VM样形态相容，但未确立功能灌注或与宿主循环的连接。肿瘤血管化可能涉及血管生成、血管捕获、VM和肿瘤-内皮协作等重叠过程；因此本研究结果被描述为VM相关和促血管生成表型，而非确切的功能性VM形成。TCGA-LIHC分析为实验发现提供人转录组背景：WTAP和TRAF6在原发HCC组织中均显著升高，并在肿瘤样本间呈中度正相关；此外WTAP-TRAF6轴评分与VM相关转录特征及血管生成、缺氧、EMT和TNFα/NF-κB通路评分正相关；WTAP表达在不同组织学分级间存在差异，WTAP高表达在基于中位数的Kaplan-Meier分析中与较短总生存期相关。这些观察与将WTAP和TRAF6与HCC侵袭性和血管可塑性相关特征联系起来的实验证据一致。因此临床分析在转录组水平涉及部分WTAP-TRAF6-VM-预后关系，但未提供WTAP和TRAF6与PAS阳性/CD31阴性结构的患者组织共定位；此外预后评估针对WTAP表达而非组织学定义的VM终点，未声称TRAF6、轴评分或VM相关特征为独立预后因素。然而TCGA发现仍属关联性：WTAP和TRAF6共表达不能证明WTAP直接调控TRAF6，转录组通路评分不能确立m⁶A修饰或功能性VM形成；WTAP表达与总生存期的观察关联基于未校正的Kaplan-Meier分析，不应解释为WTAP是独立预后因素的证据；此外TCGA bulk RNA测序数据不能解析WTAP、TRAF6或VM相关转录信号的细胞来源，因此仍需在患者来源HCC组织、组织微阵列、空间分辨数据集和独立临床队列中验证。还应承认若干方法学局限：原始MeRIP-qPCR实验缺乏IgG免疫沉淀及转录本水平阳性和阴性对照，新增YTHDF1 RIP实验中的IgG对照不能解决这些独立的MeRIP局限；YTHDF1参与由RNA免疫沉淀和耗竭支持，但甲基化依赖识别、位点特异性修饰、直接翻译效率和阅读蛋白依赖的mRNA降解未确立；所展示实验未包括抗siRNA的YTHDF1挽救；共培养实验未区分肿瘤细胞自主性VM与内皮辅助网络形成，异种移植研究未包括血管示踪剂或直接血流测量；所展示PAS/CD31图板为定性；动物实验未进行正式的先验功效计算，原始组织学评估未完全盲法；这些局限限制结论的机制和转化范围。未进行内源性TRAF6 3′UTR编辑，因此候选基序在天然位点中的必要性仍待检验。TRAF6与血管可塑性相关表型之间的下游信号关系也未解决：尽管TRAF6是NF-κB的已知上游调控因子且WTAP-TRAF6轴评分与TCGA TNFα/NF-κB特征正相关，但未进行NF-κB抑制、p65激活实验或通路上位性实验；同样，观察到的VE-cadherin、MMP2、MMP9等标志物变化与血管可塑性和基质重塑程序相容，但未定义特定的TRAF6至VM效应级联；因此NF-κB应被视为未来验证的候选下游机制，而非本研究中确立的依赖关系。模型身份限制这些发现的疾病特异性解释：HepG2为肝母细胞瘤来源，BEL-7402被列为污染性HeLa来源细胞系；因此这些模型中的结果不能确立成人HCC特异机制；Huh7共培养和构建体验证发现及TCGA-LIHC关联提供补充证据，但不能替代在经认证的成人HCC模型中对完整机制的验证；仅雄性异种移植设计也未涉及性别依赖效应。总之，本研究将TRAF6置于WTAP调控的程序中，该程序与细胞活力、运动、侵袭、血管样网络支持和异种移植瘤生长相关，而TCGA-LIHC分析提供补充证据表明WTAP和TRAF6共表达与人HCC血管可塑性相关转录程序有关。WTAP表达与TRAF6 mRNA的m⁶A富集增加和稳定性相关，挽救实验确立了TRAF6的功能性贡献。新增实验提示YTHDF1参与TRAF6蛋白调控，但未将该阅读蛋白直接与转录本稳定化联系起来。进一步研究应定位相关m⁶A位点并区分阅读蛋白依赖的翻译、蛋白周转和RNA稳定性，在原位模型中评估仅肿瘤细胞VM和血管灌注，并在人HCC标本中验证该通路。结论：总之，本研究提示WTAP至少部分通过TRAF6依赖的调控促进细胞活力、运动、侵袭、血管样网络支持和异种移植瘤生长，该调控与TRAF6 m⁶A富集和mRNA稳定性增加相关。WT/MUT报告基因反应、YTHDF1相关的TRAF6 RNA回收及YTHDF1耗竭后TRAF6蛋白表达减弱提供额外证据提示YTHDF1参与该调控通路。这些发现支持WTAP-TRAF6对所检细胞和血管可塑性相关表型的调控，并伴定性VM样组织学。确切的甲基化位点、YTHDF1对翻译与其他转录后过程的贡献、功能性血管灌注及临床相关性仍有待确立。因此，当前数据支持一个与血管可塑性相关表型相关的部分性WTAP-TRAF6调控轴，而非完全确立的位点特异性WTAP-阅读蛋白-TRAF6-NF-κB-VM通路。