《Frontiers in Immunology》：Longitudinal trajectories of peripheral blood lymphocyte subsets and PD-1 expression as dynamic prognostic markers in lung cancer
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背景：肺癌具有高度异质性和动态演进特征。外周免疫亚群和检查点分子可反映肿瘤-免疫相互作用，但静态生物标志物无法捕捉随时间的变化。本研究旨在评估淋巴细胞亚群和PD-1表达的纵向轨迹能否为无进展生存期（PFS）提供实时风险分层。方法：本回顾性队列纳入442例肺癌患
背景：肺癌具有高度异质性和动态演进特征。外周免疫亚群和检查点分子可反映肿瘤-免疫相互作用，但静态生物标志物无法捕捉随时间的变化。本研究旨在评估淋巴细胞亚群和PD-1表达的纵向轨迹能否为无进展生存期（PFS）提供实时风险分层。方法：本回顾性队列纳入442例肺癌患者，其外周血样本来自一项机构生物样本库的前瞻性采集。样本于基线及多次随访时获取。研究人员采用流式细胞术检测了CD4+T细胞、CD8+T细胞和自然杀伤（NK）细胞的频率，以及CD4+和CD8+T细胞上的PD-1水平。研究人员采用Kaplan–Meier法和时间依赖性Cox模型评估其与PFS的关联，并通过Harrell's C指数评估区分度。结果：平均年龄为63.1±8.4岁；76%为男性，77%为非小细胞肺癌（NSCLC），81%处于晚期。疾病进展（PD）发生率为13.1%。纵向分析揭示了PD患者中独特的免疫改变。在单免疫变量时间依赖性Cox模型中，时间更新的CD8+/PD-1是一个独立危险因素（HR=9.40，95%CI：1.51–58.7，p=0.017），而其他免疫亚群在总体人群中不显著。亚组分析显示，CD8+/PD-1的不良效应在NSCLC（HR=545.5，p=0.003）、小细胞肺癌（SCLC）（HR=666.0，p=0.034）、早期（HR=2067.7，p=0.015）和晚期（HR=248.8，p=0.005）患者中一致存在。时间更新的CD4+/PD-1在NSCLC（HR=0.003，p=0.009）和晚期（HR=0.005，p=0.012）患者中具有保护作用。高基线CD8+/PD-1预示着更短的中位PFS（p=0.020）。时间更新模型显示出良好的区分度（C指数0.694）。结论：动态CD8+/PD-1轨迹提供了独立的、不良的预后价值，而保存完好的CD4+/PD-1则在特定亚组中反映了免疫能力。连续监测能够实现肺癌的实时风险评估和个体化管理。
研究背景与问题
肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占大多数。尽管以程序性死亡受体1（programmed death-1, PD-1）/程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）轴为靶点的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）显著改善了部分患者的预后，但临床结局仍高度异质，相当比例的患者出现原发性或获得性耐药。目前临床决策主要依赖基线时的静态组织生物标志物，如PD-L1表达和肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）。然而，这些静态指标无法捕捉治疗压力下宿主-肿瘤免疫相互作用的动态演变特性。已有证据表明，静态病理学终点（如主要病理缓解后的复发）和影像学评估（如假性进展导致的误分类）均存在局限性。因此，亟需一种能够进行实时风险分层和疗效监测的动态生物标志物。液体活检，特别是循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）的纵向分析已展现出前景，但对外周免疫系统的动态监测同样重要。外周血淋巴细胞亚群，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和自然杀伤（natural killer, NK）细胞，以及T细胞上PD-1的表达，被认为是反映肿瘤微环境演变的微创窗口。既往研究已在肝细胞癌和NSCLC中验证了这些指标的动态变化与预后的相关性，但缺乏利用时间依赖性分析方法对其纵向轨迹进行系统性评估的研究。为此，研究人员开展了本研究，旨在通过时间依赖性Cox比例风险模型，评估外周血免疫表型纵向轨迹对肺癌患者无进展生存期（progression-free survival, PFS）的预后价值。
研究设计与方法
这是一项回顾性观察性队列研究，数据来源于中日友好医院（China-Japan Friendship Hospital, CJFH）2018年7月至2024年10月期间的生物样本库。共纳入442例经病理确诊的肺癌患者，所有患者的外周血样本均按预设的监测计划在基线（入组前）及后续随访（第2至第9次访视）中前瞻性采集。主要技术方法包括：① 流式细胞术分析：用于定量检测淋巴细胞亚群的频率及PD-1表达水平，具体指标包括CD4+T细胞%（占淋巴细胞的百分比）、CD8+T细胞%、NK细胞%、CD4+/PD-1%（CD4+T细胞中表达PD-1的百分比）和CD8+/PD-1%；② 时间依赖性Cox比例风险模型：采用计数过程数据结构将每位患者的随访期分割为连续的风险区间，在每个区间内使用最近一次测量的免疫标志物绝对值来更新风险估计，从而评估动态免疫表型与PFS的关联；③ 嵌套模型比较：通过比较仅含临床协变量的模型、加入基线免疫标志物的模型以及加入时间更新免疫标志物的模型，评估动态生物标志物的增量预后价值，模型区分度通过Harrell's C指数评估。
研究结果
1. 基线特征：队列中77%为NSCLC，76%为男性，平均年龄63.1±8.4岁。疾病进展（progressive disease, PD）组与非进展（No PD）组相比，PD组患者更年轻（60.5 vs 63.3岁，p=0.021）、接受手术的比例更低（28% vs 47%，p=0.009）、IV期患者占比更高（72% vs 53%，p=0.006）。
2. 免疫标志物的纵向趋势：通过局部加权散点图平滑法（Locally Estimated Scatterplot Smoothing, LOESS）描述免疫标志物的动态轨迹。结果显示，PD组中CD8+/PD-1水平呈持续上升趋势，而CD4+/PD-1水平则相对下降或受抑制，导致CD4+-PD1/CD8+-PD1比值在PD组中持续较低，提示向耗竭样免疫表型的渐进性失衡。线性混合效应模型显示，CD8+/PD-1、CD4+/PD-1和NK细胞计数组别×时间的交互作用均接近统计学显著性（p值分别为0.088、0.085和0.092）。按组织学分层后，NSCLC中PD患者表现为淋巴细胞水平早期下降后缓慢恢复，PD-1表达逐渐升高；而小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）患者则表现出更急剧的免疫侵蚀，淋巴细胞、NK细胞和T细胞计数在诊断后20个月内迅速下降。
3. 与无进展生存期的关联：在总体人群中，单免疫变量时间依赖性Cox模型（校正年龄、性别、TNM分期、组织学和手术状态）显示，仅时间更新的CD8+/PD-1是疾病进展的独立危险因素（HR=9.40，95%CI: 1.51–58.7，p=0.017）。亚组分析中，CD8+/PD-1的不良效应在所有亚组中一致，包括NSCLC（HR=545.5，p=0.003）、SCLC（HR=666.0，p=0.034）、早期（HR=2067.7，p=0.015）和晚期（HR=248.8，p=0.005）。相反，时间更新的CD4+/PD-1在NSCLC（HR=0.003，p=0.009）和晚期患者（HR=0.005，p=0.012）中表现出保护作用。
4. 模型比较与敏感性分析：嵌套模型比较显示，仅含临床协变量的模型C指数为0.637；加入基线免疫标志物后升至0.687；而加入时间更新免疫标志物的模型达到0.694，表明动态免疫生物标志物提供了超越传统临床因素的增量预后价值。进一步校正治疗类型（化疗-免疫联合、单纯化疗、单纯免疫治疗、靶向治疗等）的敏感性分析证实，时间更新的CD8+/PD-1仍是强独立危险因素（HR=1615.7，p<0.0001），CD4+/PD-1仍具保护作用（HR=0.001，p=0.0001）。
5. 基线预后价值：Kaplan–Meier分析显示，高基线CD8+/PD-1表达组的中位PFS显著短于低表达组（40.77个月 vs 141.73个月，p=0.020）。此外，低基线CD4+-PD1/CD8+-PD1比值组的中位PFS也显著更差（31.64个月 vs 141.73个月，p<0.001）。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究的核心发现是动态监测外周免疫表型，尤其是CD4+/PD-1和CD8+/PD-1，能为肺癌进展风险提供独立预后信息。研究观察到CD8+/PD-1持续升高与不良预后相关，这符合“T细胞耗竭”的概念，但研究人员强调仅凭PD-1表达不足以定义耗竭，未来需结合TIM-3、LAG-3、TCF-1等功能标志物。与之相反，CD4+/PD-1的保护作用提示其在辅助性T细胞上可能代表抗原经历后的激活状态而非耗竭，即“免疫能力”。这种功能二分法强调了在解释PD-1作为动态生物标志物时必须考虑细胞背景。方法学上，时间依赖性Cox模型相较于传统基线分析具有显著优势，它能捕捉“实时风险”，通过将随访期分割为离散区间，利用最新的免疫表型数据更新风险估计。模型的C指数达0.694，验证了整合动态外周生物标志物进入常规肺癌监测的预后相关性。研究还讨论了亚组特异性模式：NSCLC中两种PD-1标志物均显著，提示细胞毒性耗竭与辅助能力平衡尤为重要；SCLC中仅CD8+/PD-1显著，符合其更具侵袭性的免疫侵蚀特征。研究局限性包括：外周血标志物不能完全反映肿瘤微环境动态、缺乏外部验证、后期随访样本量减少导致统计效力下降、SCLC亚组事件数有限、以及CD4+和CD8+T细胞群体由表面标志物定义而非功能表征。
研究结论：总之，本研究证明，纵向而非静态地监测外周CD4+/PD-1和CD8+/PD-1轨迹，为肺癌的实时风险分层提供了一个非侵入性框架。研究发现时间更新的CD8+/PD-1是一个独立的不良风险因素，其效应在NSCLC、SCLC、早期和晚期亚组中一致，而时间更新的CD4+/PD-1在NSCLC和晚期患者中具有保护作用。本研究的主要贡献在于方法论层面（确立了连续免疫监测结合时间依赖性分析的价值）和概念层面（证明了动态评估下CD4+/PD-1与CD8+/PD-1具有不同的预后角色）。这些结果支持纵向免疫监测在风险分层中的临床效用，以及指导及时治疗干预的潜力。需要在更大规模、按治疗分层的队列中进行前瞻性验证以确认这些发现。
