植物乳杆菌GR-4联合PD-1/PD-L1抑制剂增强胃癌免疫治疗疗效的机制研究

《Frontiers in Immunology》：Jiangshui-derived Lactobacillus plantarum GR-4 enhances the therapeutic efficacy of PD-1/PD-L1 inhibitors against gastric cancer

　　

： 目的： 探讨源自浆水的益生菌植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）GR-4能否增强胃癌对PD-1抑制剂的敏感性并重塑肿瘤免疫微环境。 方法： 建立小鼠胃癌模型。小鼠分别接受GR-4单药灌胃、PD-1阻断抗体单药治疗或GR-4联合PD-1抗体治疗。通过测量肿瘤重量评估体内抗肿瘤疗效。检测肿瘤组织内CD8+ T细胞浸润、与T细胞活化及分化相关的细胞因子水平，以及CD3+/CD8+ T细胞上活化标志物CD69的表达。采用16S rRNA测序分析肠道菌群，并进行粪便代谢组学分析，以探究GR-4对肠道菌群组成及代谢谱的调节作用。体外实验中，研究人员用GR-4联合PD-1干预处理人胃癌BGC-823细胞，并通过转录组测序进一步验证其潜在的分子调控机制。 结果： 体内结果表明，GR-4联合PD-1抗体治疗展现出显著的协同抗肿瘤活性，有效抑制肿瘤生长，同时显著减轻PD-1相关的体重下降（p < 0.01）。进一步检测显示，GR-4协同提升肿瘤浸润CD3+/CD8+ T细胞水平，并上调这些细胞上CD69的表达，从而重塑肿瘤免疫微环境。此外，GR-4无论单独给药还是联合PD-1抗体给药，均能优化肠道菌群结构，增加包括乳杆菌属（Ligilactobacillus）和拟杆菌属（Bacteroides）在内的益生菌属丰度，逆转肠道代谢紊乱，并提高乙氧基乙酸和2,5-二羟基苯甲酸等短链脂肪酸相关代谢物的水平。转录组测序显示，与对照组相比，GR-4组PD-1检查点通路显著富集（p=0.01），而PD-1抑制剂组与GR-4/PD-1抑制剂组之间未见显著富集差异（p=0.14）。 结论： 本研究首次证实植物乳杆菌GR-4可通过T细胞活化和瘤内T细胞浸润增加，与PD-1抑制剂协同抑制胃癌进展。这些发现为胃癌提供了新的理论依据和潜在的联合免疫治疗策略。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

胃癌是全球高发恶性肿瘤，在中国其发病率和死亡率长期位居各类癌症前列，构成重大公共卫生负担。传统治疗手段临床获益有限，晚期胃癌仍高度依赖化疗，而化疗疗效已进入平台期。以靶向程序性死亡受体-1（PD-1）的抗体为代表的免疫检查点抑制剂（ICIs）已成为晚期胃癌不可或缺的治疗选择。然而，单药治疗普遍存在原发或获得性耐药，客观缓解率通常仅为10%至26%，这一临床瓶颈促使研究者积极探索通过重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME）来克服耐药的联合治疗策略。已有研究报道，将抗血管生成药物与PD-1抑制剂联用可协同增强PD-1阻断的抗肿瘤活性，但部分联合方案疗效欠佳，甚至可能增加不良事件风险。因此，亟需寻找能够特异性激发抗肿瘤免疫且兼具良好安全性的新型联合策略。

在此背景下，益生菌已被证明可通过调节宿主免疫发挥抗肿瘤作用，恢复肠道菌群稳态是优化肿瘤免疫治疗的关键途径之一。益生菌可通过维持菌群稳态和调节代谢过程间接抑制胃癌发生：纠正幽门螺杆菌感染引起的胃部菌群失调，减少具核梭杆菌等致病菌定植，恢复共生菌群多样性；益生菌代谢产物（如丁酸盐）可通过激活AMPK通路和上调DNA损伤诱导转录因子3（DDIT3）诱导细胞周期阻滞和凋亡。此外，益生菌还能增强肠道屏障完整性、减轻内毒素易位、缓解全身炎症驱动的胃癌进展。近年来，源自浆水的益生菌引起越来越多的研究兴趣。浆水是中国西北地区传统发酵食品，富含益生菌、维生素C、有机酸等营养成分。乳酸菌在浆水发酵中发挥核心作用，其分泌的细菌素等抗微生物代谢产物耐药诱导潜力低，是临床抗感染治疗的有前景候选物，并对结直肠肿瘤生长显示出令人鼓舞的活性。

研究人员前期工作已证实，从浆水中分离的发酵粘液乳杆菌GR-3能显著抑制结直肠肿瘤发展。后续研究又鉴定出另一株浆水来源菌株——植物乳杆菌GR-4，该菌株可降低结合胆汁酸浓度、有效缓解胃肠炎，且相较于GR-3表现出更强的抗肿瘤效力，尤其对胃癌细胞增殖的抑制作用显著。然而，GR-4介导抗胃癌活性的确切分子机制尚未阐明，特别是其能否以及如何与当前胃癌免疫治疗（如PD-1/PD-L1抑制剂）协同增效，仍不清楚。本研究正是针对这一科学空白，系统评估植物乳杆菌GR-4联合PD-1抗体对胃癌细胞杀伤及肿瘤免疫微环境重塑的协同效应，并基于转录组学初步解析其潜在分子机制。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员建立了615系小鼠皮下MFC胃癌细胞移植瘤模型，将小鼠随机分为对照组（PBS灌胃）、GR-4组（GR-4菌悬液灌胃）、PD-1组（PD-1抗体腹腔注射）和PD-1+GR-4联合组。主要技术方法包括：采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清细胞因子水平；采用多重免疫荧光染色定量肿瘤组织内CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润；采用流式细胞术检测脾脏淋巴细胞及与MFC共培养体系中T细胞CD69活化标志物表达；对粪便样本进行16S rRNA基因V3-V4区测序分析肠道菌群组成；对粪便样本进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）代谢组学检测；对人胃癌BGC-823细胞进行转录组测序（RNA-seq）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

三、主要研究结果

3.1 GR-4协同增强PD-1在胃癌小鼠模型中的抗肿瘤效应

在615小鼠中建立皮下MFC肿瘤异种移植模型。第19天时，PD-1单药治疗组小鼠较基线体重下降约10.8%，而GR-4组（下降0.8%）和GR-4/PD-1联合组（下降1.8%）体重维持明显更好，均显著高于PD-1单药组（p < 0.01），表明GR-4能维持荷瘤小鼠体重。肿瘤生长动力学分析显示，GR-4/PD-1联合组对肿瘤生长的抑制效果最强。GR-4单药虽略微减小肿瘤体积，但差异未达统计学显著性，表明口服GR-4单独使用内在抗肿瘤活性有限。然而，GR-4与PD-1阻断抗体联合可强力协同放大PD-1介导的抗肿瘤反应，终末肿瘤重量的结果与此一致。

3.2 GR-4与PD-1协同改善肿瘤免疫微环境并发挥抗肿瘤作用

多重免疫荧光染色显示，与对照组相比，PD-1单药显著增加瘤内CD3⁺/CD8⁺ T细胞密度，而GR-4联合PD-1干预组的CD3⁺/CD8⁺ T细胞肿瘤浸润升高最为显著。血清细胞因子检测显示，联合组循环白介素-2（IL-2）水平显著升高（p < 0.01），白介素-10（IL-10）水平显著增加（p < 0.01），干扰素-γ（IFN-γ）水平显著升高（p < 0.01），而白介素-4（IL-4）和转化生长因子-β（TGF-β）无组间差异。这些数据表明，GR-4通过调节与CD8⁺ T细胞活化和分化相关的血清细胞因子水平，促进瘤内CD8⁺ T细胞积聚，从而增强PD-1治疗疗效。

3.3 GR-4协同增加CD3⁺/CD8⁺ T细胞上CD69表达水平

体外分离脾脏淋巴细胞并以GR-4和/或PD-1阻断处理，流式细胞术检测显示，GR-4和/或PD-1干预显著下调CD3⁺/CD4⁺ T细胞上CD69表达，联合组降幅最大；而GR-4或PD-1单药均显著增加CD3⁺/CD8⁺ T细胞上CD69表达，联合治疗上调最为显著。在MFC肿瘤细胞与脾淋巴细胞共培养体系中，结果模式一致。CD69是T细胞活化的关键标志物，GR-4与PD-1阻断对CD4⁺与CD8⁺ T细胞亚群CD69表达呈现相反效应，提示二者可能通过部分重叠甚至协同的机制重塑肿瘤免疫微环境。

3.4 GR-4通过调节肠道菌群和代谢物影响机体免疫微环境从而发挥抗肿瘤作用

16S rRNA测序显示，α多样性无显著组间差异，但β多样性分析显示整体微生物群落结构发生显著改变（R2 = 0.162，p = 0.022）。属水平分析显示，GR-4干预增加益生菌属乳杆菌属（Ligilactobacillus）相对丰度（PD-1组1.41% vs 联合组4.04%），拟杆菌属（Bacteroides）丰度在联合治疗后呈上升趋势（对照组2.51% vs 联合组4.63%）。门水平上，GR-4干预显著富集益生菌门拟杆菌门（Bacteroidota）（p = 0.0268）；纲水平上，GR-4增加拟杆菌纲（Bacteroidia）丰度（p = 0.0255）并减少有害的放线菌纲（Actinobacteria）（p = 0.0441）。属水平上，联合组乳杆菌属比例显著高于PD-1单药组（p = 0.0176）。种水平上，GR-4补充显著富集产短链脂肪酸的共生菌种Agathobaculum desmolans、Lachnoanaerobaculum umeaense和发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）（p < 0.01）。

3.5 GR-4通过调节肠道代谢物改善肠道菌群并影响宿主免疫功能

粪便代谢组学分析显示，GR-4/PD-1联合组与PD-1单药组、GR-4单药组与对照组之间代谢物谱均显著分离。火山图显示，GR-4组与对照组相比有51个代谢物显著上调和35个显著下调；联合组与PD-1单药组相比有146个显著上调和62个显著下调。其中，短链脂肪酸相关代谢物乙氧基乙酸在GR-4处理小鼠中较对照组增加1.52倍；抗氧化代谢物2,5-二羟基苯甲酸在联合组较PD-1单药组上调2.11倍。KEGG富集分析显示，GR-4改变代谢物主要映射至花生四烯酸代谢、丁酸代谢及多种氨基酸代谢通路，这些通路与宿主炎症和免疫反应密切相关。

3.6 GR-4可能通过靶向PD-1信号通路调节免疫应答

对人胃癌BGC-823细胞进行转录组测序显示，GR-4显著重塑BGC-823转录组谱。GR-4处理组与对照组相比有109个基因显著上调和78个显著下调；GR-4/PD-1组与PD-1单药组相比有194个显著上调和137个显著下调。KEGG通路富集显示，对照组与GR-4组比较的差异基因富集于"癌症中PD-L1表达和PD-1检查点通路"，GR-4/PD-1组与PD-1单药组比较的差异基因同样富集于该检查点信号通路。富集评分量化显示，对照组与GR-4组比较中PD-1检查点通路基因富集具有统计学显著性（p = 0.01），而PD-1组与GR-4/PD-1组比较中该通路富集未达统计学显著（p = 0.14），这可能是因为PD-1抑制剂处理本身已强烈调节PD-L1/PD-1检查点通路，加入GR-4后未诱导该通路反应进一步显著变化。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，肿瘤发展会破坏肠道微生物稳态并减少有益共生菌群丰度，肿瘤相关菌群失调进而驱动多种免疫缺陷，因此恢复肠道菌群稳态是改善癌症免疫治疗结局的有前景策略。已有研究多聚焦益生菌通过肠道菌群恢复和全身免疫增强介导的间接抗肿瘤功能，但益生菌能否直接增敏胃癌对PD-1免疫检查点阻断的反应，仍缺乏系统的体内和体外实验证据。本研究证实植物乳杆菌GR-4与PD-1免疫治疗协同抑制肿瘤生长并减轻免疫治疗相关的全身毒性。GR-4可升高抗肿瘤相关细胞因子如IL-2和IFN-γ的循环水平，重塑瘤内T细胞浸润，调节T细胞CD69活化标志物，从而重塑肿瘤免疫微环境并与PD-1抗体产生协同抗癌效应。GR-4无论单独给药还是联合PD-1阻断，均能重塑肠道菌群组成并富集乳杆菌属和拟杆菌属等共生菌属，调节包括乙氧基乙酸在内的肠道代谢物，并干扰PD-L1-PD-1癌症检查点信号轴。研究也承认存在局限性：主要评估了皮下肿瘤中的T细胞浸润，未涉及其他免疫细胞分布；未探讨GR-4辅助免疫治疗对T细胞耗竭的影响；皮下异种移植模型无法完全再现真实胃癌微环境，如独特的酸性条件和胃部菌群。未来研究将建立原位胃癌模型，阐明GR-4对多种免疫细胞浸润及T细胞功能和耗竭的影响，并通过单组分干预、代谢物靶点筛选等途径明确GR-4辅助胃癌免疫治疗的具体分子机制。此外，患者来源类器官与自体免疫细胞共培养体系可用于评估人源化实验平台中对GR-4联合PD-1抑制剂治疗的个体化反应。

研究结论：本研究首次证实源自中国传统发酵食品浆水的植物乳杆菌GR-4可通过T细胞活化和瘤内T细胞浸润增加，与PD-1抑制剂协同抑制胃癌进展。这些发现为胃癌提供了新的理论依据和潜在的联合免疫治疗策略。未来可开发富含植物乳杆菌GR-4的酸奶或饮料等功能性食品，作为接受免疫治疗的胃癌患者的口服膳食佐剂，这种"食疗"联合范式在概念上具有创新性，对胃癌综合管理具有广阔前景。