核糖体蛋白S3（RPS3）在慢性髓系白血病酪氨酸激酶抑制剂耐药中的作用及机制研究

《Frontiers in Oncology》：Role and mechanism of ribosomal protein S3 in tyrosine kinase inhibitor resistance in chronic myeloid leukemia

摘要专业翻译 引言： 对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的耐药仍然是导致慢性髓系白血病（CML）治疗失败的主要原因。本研究探讨了核糖体蛋白S3（RPS3）在TKI耐药中的作用及其与NF-κB信号传导的关联。 方法： 研究人员采用探索性RNA测序和RNA结合蛋白数据库来筛选候选分子，并随后进行临床表达及功能分析。研究人员在独立临床队列和耐药细胞模型中检测了RPS3的表达。通过RPS3敲低和药理学调控，评估了药物敏感性、凋亡、细胞周期分布及NF-κB相关信号传导的变化。 结果： RPS3在TKI耐药或疗效不佳患者的临床样本及耐药细胞模型中均呈上调表达。受试者工作特征（ROC）分析显示，在验证队列中，RPS3表达能够区分耐药/疗效不佳患者与良好应答者。RPS3敲低降低了伊马替尼和尼洛替尼的半抑制浓度（IC50）值，并在TKI暴露后增加了细胞凋亡和G0/G1期阻滞。这些效应伴随着p65磷酸化水平降低、p65核/质荧光比值下降以及MCL-1和BCL-XL mRNA水平降低。TNF-α处理增加了RPS3敲低细胞的TKI耐受性并减少了TKI诱导的凋亡，而与BAY-11-7082联合处理则可抵消这些效应。在最高单药模型（HSA）下，BAY-11-7082与TKIs在耐药细胞中亦显示出协同抑制效应。 讨论： 这些发现将RPS3确定为CML细胞模型中TKI耐药的促成因素，并将其功能效应与NF-κB相关的抗凋亡信号传导联系起来。通过整合临床表达数据与功能及药理学分析，本研究支持进一步探索RPS3作为使耐药CML细胞对TKIs增敏的候选靶点。

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一、研究背景与科学问题

慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一种由造血干/祖细胞恶性克隆扩增引起的骨髓增殖性肿瘤，其分子标志是t(9;22)(q34;q11.2)染色体易位产生的BCR::ABL1融合基因。酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）的引入显著改善了CML患者的长期预后，使许多患者实现了持续的疾病控制。然而，仍有部分患者在治疗过程中出现次优分子学反应、获得性耐药或疾病进展，TKI耐药成为限制CML治疗疗效的重要临床问题。

TKI耐药的机制大致可分为BCR::ABL1依赖性和BCR::ABL1非依赖性两类。BCR::ABL1激酶结构域突变、基因扩增和药物结合改变是经典的耐药机制，但在相当比例的耐药患者中，BCR::ABL1突变并不能完全解释治疗失败。近年研究表明，BCR::ABL1非依赖性机制——包括白血病干细胞的持续存活、骨髓微环境的保护作用、药物外排增强、表观遗传重塑以及旁路促生存信号通路的异常激活——同样参与CML耐药的发生。因此，寻找新的BCR::ABL1非依赖性耐药调控因子，对于阐明CML耐药的生物学机制、发现潜在治疗靶点以及优化联合治疗策略具有重要意义。

RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）通过调控RNA剪接、转运、稳定性、定位和翻译来影响基因表达和细胞命运。越来越多的证据表明，RBP的异常表达与肿瘤细胞增殖、干性维持、分化阻滞和治疗耐药密切相关。然而，RBPs在CML TKI耐药中的作用尚未得到充分阐明，尤其是RBPs是否通过调控BCR::ABL1非依赖性促生存通路参与耐药，仍不清楚。

核糖体蛋白S3（ribosomal protein S3，RPS3）是真核生物40S核糖体亚基的重要组成成分。除经典的核糖体功能外，RPS3还具有多种核糖体外功能，包括参与DNA损伤修复、氧化应激反应、凋亡调控以及转录因子活性的调节。既往研究显示，RPS3可作为NF-κB转录复合物的非Rel亚基，与p65相互作用并增强NF-κB靶基因的转录活性。NF-κB信号通路是肿瘤细胞中关键的促生存通路，其持续激活可上调多种抗凋亡分子，增加对药物诱导凋亡的抵抗。在CML中，NF-κB的异常激活也被认为与白血病细胞存活和TKI耐药有关。此外，RPS3已在多种癌症中被报道参与细胞生长、凋亡逃逸和治疗耐药，包括腺样囊性癌中与STAT1/NF-κB信号相关的转移和顺铂耐药、乳腺癌中XIAP表达的调控，以及多发性骨髓瘤中的蛋白酶体抑制剂耐药。这些发现提出了一个关键问题：RPS3是否也参与CML的获得性TKI耐药，其作用是否涉及NF-κB相关的生存信号传导？

二、研究内容与主要结论

针对上述问题，研究人员整合了探索性RNA测序、RBP数据库筛选、独立临床表达队列验证、耐药细胞模型建立以及RPS3功能干预等多层次手段，系统研究了RPS3在CML TKI耐药中的作用及其机制。

研究结果显示：RPS3在TKI耐药或疗效不佳患者的临床样本中以及耐药细胞模型中均呈上调表达；ROC分析显示RPS3表达能够有效区分耐药/疗效不佳患者与良好应答者；RPS3敲低显著降低了耐药细胞对伊马替尼和尼洛替尼的IC₅₀值，增加了TKI诱导的细胞凋亡和G₀/G₁期阻滞；机制层面，RPS3敲低降低了p65磷酸化水平、p65核/质荧光比值以及MCL-1和BCL-XL的mRNA水平；TNF-α处理可逆转RPS3敲低带来的TKI增敏效应，而NF-κB抑制剂BAY-11-7082可抵消TNF-α的作用；BAY-11-7082与TKIs在耐药细胞中表现出协同抑制效应。

这些发现将RPS3确定为CML细胞模型中TKI耐药的促成因素，并建立了RPS3与NF-κB相关抗凋亡信号传导之间的功能联系，为BCR::ABL1非依赖性耐药的治疗策略提供了新的理论依据和候选靶点。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：（1）探索性转录组测序：对11例慢性期CML患者（3例初诊、3例良好应答、5例耐药/疗效不佳）进行RNA测序，耐药组与良好应答组比较后进行差异基因筛选；（2）RBP数据库筛选：将差异表达基因与RNA结合蛋白数据库（RBPDB）取交集，获得候选RBP分子；（3）独立临床队列验证：在包含30例耐药/疗效不佳患者和32例良好应答患者的独立队列中，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证RPS3 mRNA表达差异，并进行ROC分析；（4）耐药细胞模型：使用K562亲本细胞及长期药物压力筛选建立的伊马替尼耐药（K562-IMR）、尼洛替尼耐药（K562-NIR）和双药耐药（K562-(IM+NI)R）细胞模型；（5）基因功能干预：通过慢病毒介导的shRNA实现RPS3稳定敲低；（6）功能检测：CCK-8法检测药物敏感性、流式细胞术检测凋亡和细胞周期、Western blot检测蛋白表达、免疫荧光检测p65核/质分布；（7）药理学调控：使用TNF-α激活NF-κB通路、BAY-11-7082抑制NF-κB通路；（8）药物协同分析：使用SynergyFinder软件基于最高单药（HSA）模型分析药物联合效应。

四、研究结果

3.1 探索性RNA测序和独立验证确定RPS3在TKI耐药CML中上调

研究人员对11例患者进行转录组测序，以耐药组与良好应答组比较筛选差异表达基因，并与RBPDB取交集获得28个RBP相关候选分子，其中5个在耐药组中表达较高：TRMT2A、DUS3L、TUT1、RPS3和ZFR2。RPS3因具有最高的标准化读数丰度，且既往文献支持其与生存信号和药物耐药相关，被优先选为后续研究对象。在独立的临床队列中，RT-qPCR证实耐药/疗效不佳组（n=30）的RPS3 mRNA表达显著高于良好应答组（n=32）。ROC分析显示AUC为0.9278（95% CI: 0.8648–0.9908），表明RPS3表达对研究定义的反应分组具有强区分能力。此外，耐药细胞模型的RPS3 mRNA和蛋白水平均高于亲本K562细胞。

3.2 RPS3敲低增强耐药细胞对TKIs的敏感性

通过慢病毒介导的shRNA成功建立了RPS3稳定敲低的耐药细胞模型，RT-qPCR和Western blot证实敲低效率。CCK-8剂量反应分析显示，经伊马替尼或尼洛替尼处理后，RPS3敲低细胞的活力下降更为显著，IC₅₀值显著低于相应的shNC对照组，表明RPS3敲低增强了耐药细胞对TKIs的敏感性。

3.3 RPS3敲低增强TKI诱导的凋亡和G₀/G₁期阻滞

Annexin V/7-AAD双染流式分析显示，在TKI处理后，RPS3敲低组的凋亡细胞比例显著高于shNC对照组，包括早期凋亡细胞和晚期凋亡/死亡细胞。值得注意的是，在无TKI处理条件下，RPS3敲低并未引起明显的自发凋亡增加。细胞周期分析显示，TKI处理后RPS3敲低细胞中G₀/G₁期细胞比例显著增加，而无药物处理时各组间细胞周期分布无明显差异。这些结果表明RPS3下调增强了耐药细胞对TKI诱导凋亡和细胞周期阻滞的响应。

3.4 RPS3敲低降低NF-κB激活标志物及MCL-1和BCL-XL mRNA水平

Western blot分析显示，RPS3敲低显著降低了磷酸化p65（p-p65）水平，而总p65表达基本不变。免疫荧光分析显示，RPS3敲低细胞的p65核/质荧光比值显著低于shNC对照组，表明p65核积累减少。RT-qPCR分析显示，MCL-1和BCL-XL mRNA水平在耐药细胞中显著升高，而RPS3敲低后其表达显著下降。这些发现将RPS3敲低带来的TKI增敏效应与NF-κB激活标志物减少及抗凋亡基因表达下调联系起来。

3.5 TNF-α抵消RPS3敲低细胞的TKI增敏效应

为验证NF-κB信号通路的功能参与，研究人员使用TNF-α激活NF-κB信号、BAY-11-7082抑制NF-κB信号。结果显示，TNF-α处理增加了K562-IMR-shRPS3和K562-NIR-shRPS3细胞中相应TKIs的IC₅₀值，且20 ng/mL TNF-α的效果高于10 ng/mL。联合BAY-11-7082处理后，IC₅₀值回落至接近无TNF-α处理的水平。凋亡分析呈现对应模式：TNF-α减少了TKI诱导的凋亡，而BAY-11-7082联合处理使凋亡率回升至shRPS3+TKI组的水平。这些结果为NF-κB相关信号参与RPS3敲低细胞的TKI反应提供了药理学支持。

3.6 BAY-11-7082与TKIs在耐药CML细胞中显示协同抑制效应

研究人员在K562-IMR和K562-NIR细胞中分别以BAY-11-7082与伊马替尼或尼洛替尼的浓度矩阵联合处理，采用HSA模型分析药物相互作用。结果显示，伊马替尼/BAY-11-7082联合在K562-IMR细胞中的HSA协同评分为13.05，尼洛替尼/BAY-11-7082联合在K562-NIR细胞中的评分为18.64，均超过协同阈值10，表明两种联合方案在耐药细胞中具有协同抑制效应。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究通过将临床表达发现与药物敏感性功能证据相结合，确定了RPS3是CML细胞模型中TKI耐药的促成因素。RPS3敲低增强TKI诱导的凋亡和G₀/G₁期阻滞，伴随p65磷酸化降低、p65核/质比值下降及MCL-1和BCL-XL mRNA水平降低，支持RPS3通过NF-κB相关抗凋亡机制维持耐药表型的模型。研究还讨论了RPS3作为40S核糖体亚基成分的核糖体外功能，及其在NF-κB转录复合物中的非Rel亚基角色，将RPS3与NF-κB驱动的生存程序联系起来。在CML中，NF-κB信号已被既往研究涉及细胞存活和TKI耐药，本研究将RPS3作为与该生存反应相关的候选调控因子加以补充。抗凋亡BCL-2家族成员（MCL-1和BCL-XL）被认为是连接生存信号改变与TKI敏感性的合理下游组分。药理学实验（TNF-α和BAY-11-7082）为NF-κB相关信号在RPS3耗竭后药物反应中的相关性提供了功能维度证据。BAY-11-7082与TKIs的协同效应支持进一步探索TKI联合生存信号干扰的治疗策略。

研究结论为：本研究将临床样本中RPS3表达升高与CML细胞模型中TKI耐药的功能贡献联系起来。RPS3敲低增强TKI诱导的凋亡和G₀/G₁期阻滞，伴随NF-κB激活标志物减少和MCL-1及BCL-XL mRNA水平降低。药理学发现进一步支持NF-κB相关生存信号的参与。这些结果支持提出的RPS3/NF-κB/MCL-1/BCL-XL模型，并将RPS3确定为BCR::ABL1非依赖性CML耐药中值得进一步研究的候选调控因子，为旨在使耐药细胞对TKIs增敏的策略提供了理论依据。

研究同时指出了若干局限性：功能实验主要在耐药细胞系中进行，需在原发性患者细胞和体内模型中验证；NF-κB转录活性未被直接测量；MCL-1和BCL-XL仅在mRNA水平检测，蛋白水平、转录及启动子占用实验和遗传功能缺失/回复实验仍需开展；TNF-α/BAY-11-7082实验提供药理学支持但未建立NF-κB特异性因果关系；RPS3的核糖体功能与核糖体外功能的区分尚需进一步研究；药物联合仅在体外基于HSA模型评估，需更多相互作用模型和体内疗效及耐受性研究。治疗意义仍处于临床前阶段。